周湘潔，牛東濱，郭志剛，王 亮，趙 琦，杜學(xué)禮，竇躍龍

1中國人民解放軍總裝備部后勤部航天城門診部;2中國航天員科研訓(xùn)練中心，北京，100094;3清華大學(xué)化工系，北京 100084

竹節(jié)參(Panax japonicus C.A.Meyer)是五加科人參屬植物，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、活血化瘀、消腫止痛、健胃、祛痰、解熱的功效，主治跌打損傷，筋骨疼痛，風(fēng)濕痹癥，是我國的一種名貴中草藥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，竹節(jié)參具有抗?jié)?、保肝、?zhèn)靜、鎮(zhèn)驚、抗疲勞、損傷保護(hù)、免疫、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等多種活性［1］。有學(xué)者的研究表明，竹節(jié)參提取物能夠抑制血栓的形成［2］，對完全性和不完全性腦缺血、胃缺血、心肌缺血以及再灌注損傷動物模型具有保護(hù)作用［3-6］;竹節(jié)參皂苷能夠抑制腦及心肌缺血缺氧的損傷，減輕組織水腫，可能與其改善機(jī)體自由基代謝、干預(yù)缺血后的細(xì)胞凋亡等有關(guān)［7-10］。但有關(guān)竹節(jié)參總皂苷在抗低壓缺氧方面的研究尚未見報道。

在載人航天在軌飛行中，當(dāng)航天員出艙活動往返于軌道艙和氣閘艙之間時，面臨的風(fēng)險之一就是急性低壓缺氧，高原作業(yè)以及疾病發(fā)生過程中也會經(jīng)常發(fā)生缺氧狀況。本實驗擬將大鼠暴露于模擬海拔8000 m低壓缺氧艙內(nèi)8 h，建立動物急性低壓缺氧模型，以紅景天提取物為中藥陽性對照，尼莫地平為西藥陽性對照，竹節(jié)參總皂苷為實驗對象，通過光鏡對實驗動物的心腦組織細(xì)胞變化進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，以研究急性低壓缺氧對機(jī)體產(chǎn)生的損傷和藥物的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物選用Wistar大鼠，雄性，4月齡，體重195～212 g。由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。實驗動物合格證號SCXK(京)2006-0009。竹節(jié)參總皂苷，由清華大學(xué)化工系生化所利用索式提取以及制備色譜法從竹節(jié)參培養(yǎng)細(xì)胞中提取分離獲得。尼莫地平注射液:4 mg∶20 mL，(批號:0503101，山東亞寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn));紅景天提取物(由“八一”體工隊藥物研究所提供)。動物加壓減壓實驗艙:蕪湖潛水設(shè)備廠生產(chǎn)。

1.2 動物分組設(shè)計

選取Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為5組，每組12只。即①竹節(jié)參總皂苷組，②紅景天提取物組，③尼莫地平組，④陰性對照組(低壓處理對照組)，⑤空白對照組(常壓處理對照組)。

1.3 給藥方法

竹節(jié)參總皂苷與紅景天提取物分別制成溶液。實驗動物采用分籠飼養(yǎng)，每籠6只，自由采食。適應(yīng)飼養(yǎng)4 d后，①、②、③組每日清晨灌胃給藥，劑量為:①組為相當(dāng)于竹節(jié)參總皂苷100 mg/kg，②組為相當(dāng)于紅景天提取物量100 mg/kg，③組為相當(dāng)于尼莫地平1 mg/kg，④、⑤組灌胃給與等量生理鹽水。動物連續(xù)灌胃給藥14 d。

1.4 大鼠急性低壓缺氧模型的制備方法

實驗動物分組灌胃給藥14 d后，于末次給藥30 min后開始進(jìn)行急性低壓缺氧實驗，將動物置于動物加壓減壓實驗艙內(nèi)(艙容積為1 m3)，關(guān)閉艙門，調(diào)整艙內(nèi)壓力漸減，在10 min左右將艙內(nèi)壓力減至0.068 MPa(相當(dāng)于以10 m/s上升至海拔8000 m)，維持此壓力8 h，制備大鼠急性低壓缺氧模型，艙內(nèi)溫度保持為恒溫16℃，完成缺氧時間后將艙內(nèi)壓力升至正常大氣壓，速度仍為10 m/s;空白對照組置于實驗艙附近，于正常大氣壓下滯留8 h。動物出艙后30 s內(nèi)迅速斷頭、取血、分離腦組織，進(jìn)行觀察、保存和檢測。

1.5 組織切片樣本處理

每組隨機(jī)取3只大鼠，切除右側(cè)半腦，置于4℃磷酸鹽緩沖液(0.01M PBS，pH=7.3)中洗去血液，用小塊紗布包裹，鉛筆標(biāo)記，置于10%的福爾馬林溶液中，同樣方法取心肌組織并保存。

1.6 腦組織含水量測定

大鼠斷頭取腦后，用濾紙吸去腦表面的水分，每組取9只大鼠的右側(cè)半腦，分析天平稱濕重(w)，用鋁箔紙分別包裹標(biāo)記，置110℃烘箱內(nèi)烘干24 h至恒重(D)，用干濕重法(H2O)%=〔(W-D)/W ×100%〕計算每份腦組織水含量，結(jié)果用%表示。并用鄧肯氏測驗法對不同處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行了差異顯著性分析。

1.7 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察

將心肌、腦組織分別置于4℃磷酸鹽緩沖液(0.01M PBS，pH=7.3)中洗去血液，用 10% 福爾馬林固定。通過脫水、透明處理、浸蠟、包埋、切片、用蘇木素染色液染色、水洗、伊紅復(fù)染、脫水透明和樹脂封固等步驟，再置于光學(xué)顯微鏡下觀察心、腦組織細(xì)胞形態(tài)變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 竹節(jié)參總皂苷對Wistar大鼠腦組織含水量的影響

實驗結(jié)果如表1所示，與空白對照組相比，各低壓缺氧模型組Wistar大鼠的腦組織含水量均顯著升高。其中竹節(jié)參總皂苷組、紅景天提取物組和尼莫地平組等三個給藥組的腦組織含水量沒有顯著性差異，但是均顯著低于陰性對照組。表明竹節(jié)參總皂苷、紅景天提取物和尼莫地平給藥的Wistar大鼠，在低壓缺氧環(huán)境下均具有抑制腦組織水腫的作用。因此可以證明竹節(jié)參總皂苷具有與紅景天提取物相同的抗腦組織水腫的效果，該結(jié)果與劉家蘭［4］等的實驗結(jié)論基本相同。至于竹節(jié)參總皂苷抑制腦組織水腫的作用機(jī)理，可能與竹節(jié)參總皂苷具有抗氧化、抑制氧自由基生成［6，8］，抑制了細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，改善了細(xì)胞膜的鈣離子釋放等作用相關(guān)。具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

表1 竹節(jié)參總皂苷對急性低壓缺氧大鼠腦組織含水量的影響Table 1 Effect of PJTS on brain tissue water content of rat in acute hypobaric hypoxia

2.2 竹節(jié)參總皂苷對急性低壓缺氧Wistar大鼠腦組織和細(xì)胞損傷的抑制效果

從腦組織外觀和顯微觀察(圖1)發(fā)現(xiàn)，空白對照組Wistar大鼠的腦組織形態(tài)顯示腦膜血管無擴(kuò)張，腦組織無腫脹;腦組織切片顯示，腦各部位結(jié)構(gòu)及層次明顯，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整，腦實質(zhì)中細(xì)胞核仁清晰，神經(jīng)纖維細(xì)胞縱橫交錯，排列致密(圖1a)。而陰性對照組的形態(tài)顯示，腦膜血管中度擴(kuò)張，腦組織細(xì)胞極度腫脹;腦組織切片顯示，腦各部位結(jié)構(gòu)及層次紊亂，細(xì)胞水腫明顯，胞漿變寬，淡染，排列紊亂，間質(zhì)疏松水腫(圖1b)。竹節(jié)參總皂苷給藥組的形態(tài)顯示腦膜血管輕度擴(kuò)張，腦組織輕度腫脹;腦組織切片顯示，腦各部位結(jié)構(gòu)及層次較陰性對照組清楚，腦組織結(jié)構(gòu)變化不大，細(xì)胞水腫不明顯，胞漿減少，極性存在，間質(zhì)輕微疏松，有少量細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，胞漿有空泡化現(xiàn)象(圖1c)。紅景天提取物給藥組的形態(tài)顯示腦膜血管輕度擴(kuò)張，腦組織輕度腫脹;腦組織切片顯示，細(xì)胞有輕度水腫，細(xì)胞腫脹，間質(zhì)疏松(圖1d)。尼莫地平給藥組的形態(tài)顯示腦膜血管中度擴(kuò)張，腦組織中度腫脹;腦組織切片顯示，腦各部位結(jié)構(gòu)及層次較陰性對照組清楚，細(xì)胞水腫較明顯，部分細(xì)胞變形，胞漿減少，胞漿空泡化，間質(zhì)疏松(圖1e)。實驗結(jié)果表明，在急性低壓缺氧環(huán)境下，Wistar大鼠的腦組織和細(xì)胞會受到極大損傷。竹節(jié)參總皂苷、紅景天提取物和尼莫地平給藥組的Wistar大鼠雖然在急性低壓缺氧環(huán)境下，其腦細(xì)胞同樣受到傷害，但是與陰性對照組相比其損傷癥狀明顯減輕。特別是竹節(jié)參總皂苷給藥組的腦細(xì)胞雖然有輕度水腫，但是基本保持清晰完整。表明竹節(jié)參總皂苷在急性低壓缺氧環(huán)境下可以保護(hù)Wistar大鼠腦細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的完整性。

圖1 竹節(jié)參總皂苷對急性低壓缺氧大鼠腦組織和細(xì)胞形狀的影響(光鏡HE染色，×400)Fig.1 Effect of PJTS on brain tissue cell morphology of rat in acute hypobaric hypoxia(microscopy with HE staining，×400)

2.3 竹節(jié)參總皂苷對急性低壓缺氧Wistar大鼠心肌組織和細(xì)胞損傷的抑制效果

從心肌組織外觀和顯微觀察(圖2)發(fā)現(xiàn)，空白對照組的形態(tài)顯示W(wǎng)istar大鼠的心肌組織無腫脹，無異常變化;組織切片顯示，心肌各部位結(jié)構(gòu)及層次清楚，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整，心肌纖維細(xì)胞縱橫交錯，排列有致(圖2a)。而陰性對照組的形態(tài)顯示心肌膜血管中度擴(kuò)張，組織腫脹;組織切片顯示心肌各部位結(jié)構(gòu)及層次紊亂，細(xì)胞水腫明顯，細(xì)胞變形、胞漿變寬，淡染，排列紊亂，間質(zhì)疏松水腫(圖2b)。竹節(jié)參總皂苷給藥組的形態(tài)顯示心肌膜血管輕度擴(kuò)張，組織輕度腫脹;組織切片顯示細(xì)胞輕度水腫，心肌組織結(jié)構(gòu)變化不大，有少量細(xì)胞腫脹，間質(zhì)輕微疏松，胞漿有空泡化現(xiàn)象(圖2c)。紅景天提取物給藥組的形態(tài)顯示心肌膜血管輕度擴(kuò)張，組織輕度腫脹;組織切片顯示細(xì)胞有輕度水腫，腫脹，胞漿減少，極性存在，間質(zhì)輕微疏松(圖2d)。尼莫地平給藥組的外觀顯示大鼠心肌膜血管輕度擴(kuò)張，組織腫脹;組織切片顯示細(xì)胞水腫較明顯，細(xì)胞腫脹，部分細(xì)胞胞漿變寬，排列紊亂(圖2e)。實驗結(jié)果表明，在急性低壓缺氧環(huán)境下，Wistar大鼠的心肌組織和細(xì)胞會受到極大損傷。竹節(jié)參總皂苷、紅景天提取物和尼莫地平給藥組的Wistar大鼠雖然在急性低壓缺氧環(huán)境下，其心肌細(xì)胞同樣受到一定傷害，但是與陰性對照組相比其損傷程度明顯減輕。特別是竹節(jié)參總皂苷給藥的心肌細(xì)胞雖然有輕度水腫，但是基本保持清晰完整。表明竹節(jié)參總皂苷在急性低壓缺氧環(huán)境下，可以有效保護(hù)Wistar大鼠的心肌組織和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)以及功能的完整性。

總之，從組織和細(xì)胞的形態(tài)變化可以明顯看到竹節(jié)參總皂苷在急性低壓缺氧環(huán)境下，對于Wistar大鼠的腦和心肌細(xì)胞均具有良好的保護(hù)作用。至于其作用機(jī)理可能與竹節(jié)參總皂苷具有抗氧化、清除氧自由基，維護(hù)細(xì)胞膜通透性，抑制腦和心肌缺血損傷密切相關(guān)［3-10］，但是由于竹節(jié)參總皂苷中含有竹節(jié)參皂苷、人參皂苷和三七皂苷等，其保護(hù)效果不是某單一物質(zhì)在起作用，而是多種皂苷類化合物綜合作用的結(jié)果。如果要徹底解析其作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步深入探討。

圖2 竹節(jié)參總皂苷對急性低壓缺氧大鼠心肌組織細(xì)胞形態(tài)的影響(光鏡HE染色×400)Fig.2 Effect of PJTS on myocardial tissue cell morphology of rat in acute hypobaric hypoxia(microscopy with HE staining，× 400)

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