楊建輝 呂建國(guó) 王 輝 申曉東 (西安交通大學(xué)第一醫(yī)院疼痛科，陜西 西安 710061)

蛋白聚糖是軟骨細(xì)胞分泌的一種蛋白多糖大分子，是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一。在骨關(guān)節(jié)炎(OA)發(fā)病機(jī)制的研究中，人們發(fā)現(xiàn)蛋白聚糖和膠原纖維的降解是OA發(fā)病的主要生理和病理學(xué)基礎(chǔ)〔1〕。氨基葡萄糖不僅可以減輕OA疼痛癥狀，同時(shí)可以延緩OA的病理改變，為改變病情藥物〔2〕。本研究利用體外培養(yǎng)OA患者軟骨細(xì)胞體系，通過(guò)檢測(cè)軟骨細(xì)胞糖胺多糖(GAG)及蛋白聚糖代謝片段的變化，以及蛋白聚糖、可聚蛋白聚糖酶-1(Aggrecanase-1)和可聚蛋白聚糖酶-2(Aggrecanase-2)mRNA的表達(dá)，了解氨基葡萄糖對(duì)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)誘導(dǎo)OA軟骨細(xì)胞蛋白聚糖分解代謝的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 胰蛋白酶、細(xì)胞培養(yǎng)液達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)基(DMEM)/F12(Gibco公司)，Ⅱ型膠原酶、IL-1β(Sigma公司)，噻唑藍(lán)(MTT，Amresco公司)，二甲基亞甲藍(lán)(DMMB，Serva公司)，硫酸軟骨素A(Seikagaku Kogyo公司)，總RNA提取試劑盒(RNeasy MiniKit，QIAGEN Pty Led Australia)，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑(華美生物制品公司)，抗蛋白聚糖單克隆抗體(monoclonal antibody，Mab)3B3及5D4(Invitrogen公司)，引物由上海生工生物工程有限公司提供。氨基葡萄糖(商品名:伊索佳-浙江海正藥業(yè)生產(chǎn))。

1.2 含藥血清和正常兔血清的制備 根據(jù)文獻(xiàn)〔3〕，將氨基葡萄糖按體表面積折算動(dòng)物的等效劑量，再用生理鹽水配成8 ml溶液給新西蘭大白兔灌胃，正常兔血清則以生理鹽水8 ml灌胃。連續(xù)2次灌胃，中間間隔2 h，在末次灌胃的3 h后，乙醚和氯胺酮復(fù)合麻醉下腹主動(dòng)脈采血，4℃冰箱過(guò)液后，離心2 500 r/min ×25 min，抽取血清，56℃、30 min 滅活，經(jīng) 0.45 μm濾膜抽濾除菌、分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 軟骨細(xì)胞取自O(shè)A患者進(jìn)行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的軟骨組織，參考文獻(xiàn)〔4〕，用尖刀片仔細(xì)分離脛骨平臺(tái)、股骨髁以及髕骨關(guān)節(jié)面的軟骨。將軟骨塊用D-Hank's液漂洗，剪碎至1 mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶消化30 min，然后再加入0.2%Ⅱ型膠原酶，置震蕩器上，37℃震蕩消化1 h，將游離出的帶有酶溶液的軟骨細(xì)胞用吸管吸出，120目尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾，獲取軟骨細(xì)胞，細(xì)胞活力分析儀檢測(cè)細(xì)胞活力＞95%。將消化所得的細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，密度為105cells/ml(Vi-cell細(xì)胞活力分析儀計(jì)數(shù))接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日倒置顯微鏡觀察，隔2～3 d換液，原代貼壁細(xì)胞單層融合后按1∶2傳代。第一代軟骨細(xì)胞采用MTT法檢測(cè)不同濃度IL-1β和含氨基葡萄糖血清兔血清存在條件下的細(xì)胞存活率，選擇細(xì)胞存活率均≥95%的適當(dāng)IL-1β和含氨基葡萄糖血清濃度做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果IL-1β濃度為10 ng/ml，含氨基葡萄糖兔血清最高濃度為40%。

1.4 加藥培養(yǎng) 將第一代軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)入12孔的組織細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)為1.5×105/L，培養(yǎng)48 h后，用不含小牛血清的培養(yǎng)液洗2次，此后的培養(yǎng)均采用無(wú)小牛血清的培養(yǎng)液，以去除小牛血清對(duì)GAG和蛋白聚糖分解片段測(cè)定的干擾。吸棄孔中培養(yǎng)液，進(jìn)行試驗(yàn)分組。實(shí)驗(yàn)分為5組，A組(兔血清對(duì)照組):培養(yǎng)液中無(wú)任何刺激因子，每孔加入正常兔血清100 μl;B組(IL-1β對(duì)照組):培養(yǎng)液含10 ng/ml IL-1β+正常兔血清100 μl;C組:培養(yǎng)液含10 ng/ml IL-1β+10%含氨基葡萄糖血清100 μl;D組:培養(yǎng)液含10 ng/ml IL-1β+20%含氨基葡萄糖血清100 μl;E組:培養(yǎng)液含10 ng/ml IL-1β+40%含氨基葡萄糖血清100 μl;每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)48 h進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 溶解軟骨細(xì)胞用于測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GAG含量 全過(guò)程均在碎冰上進(jìn)行。將細(xì)胞培養(yǎng)板移至碎冰上，用1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)輕柔洗細(xì)胞1次，然后每孔加人300 μl細(xì)胞溶解液，冰上作用20 min，將溶解液移至離心管，4℃離心10 min，收集上清液透析后儲(chǔ)存于－20℃，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GAG。

1.6 軟骨細(xì)胞及培養(yǎng)液中GAG的測(cè)定 GAG的含量測(cè)定是檢測(cè)蛋白聚糖代謝的一個(gè)常用指標(biāo)〔5〕。體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，GAG釋放入培養(yǎng)液中的水平代表蛋白聚糖的降解程度，釋放入培養(yǎng)液中的GAG越多，表明蛋白聚糖的降解越明顯。本實(shí)驗(yàn)采用GAG釋放至培養(yǎng)液中的量占總體GAG(細(xì)胞內(nèi)+培養(yǎng)液)的百分率表示蛋白聚糖的降解程度。GAG的含量采用DMMB分光光度法測(cè)定〔2〕，以硫酸軟骨素A作為標(biāo)準(zhǔn)參照物，計(jì)算測(cè)定結(jié)果。

1.7 競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定蛋白聚糖的兩種代謝片段 Mab 3B3和5D4(購(gòu)自Invitrogen公司)為兩種識(shí)別蛋白聚糖不同代謝片段的Mab。Mab-3B3可檢測(cè)蛋白聚糖中核心蛋白區(qū)硫酸軟骨素(CS)的特定片段，是蛋白聚糖合成的標(biāo)記。Mab-5D4可與蛋白聚糖核心蛋白區(qū)的硫酸角質(zhì)素(KS)鏈中重復(fù)出現(xiàn)的硫酸化己糖結(jié)合，是蛋白聚糖降解的標(biāo)志物〔6〕。ELISA方法參照 Chan等〔7〕的方法，標(biāo)準(zhǔn)參照物為軟骨素酶處理后的蛋白多糖。

1.8 RT-PCR檢測(cè)軟骨細(xì)胞蛋白聚糖、可聚蛋白聚糖酶-1和可聚蛋白聚糖酶-2 mRNA的表達(dá) 選取經(jīng)不同處理因素作用48 h的12孔板細(xì)胞，每孔加入1 ml Trizol按說(shuō)明書(shū)提取總RNA;然后通過(guò)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以18 S mRNA作為內(nèi)對(duì)照，對(duì)比分析各組軟骨細(xì)胞內(nèi)蛋白聚糖、可聚蛋白聚糖酶-1和可聚蛋白聚糖酶-2基因mRNA的表達(dá)量。各基因的上下游引物序列以及退火溫度見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為:上下游引物各 0.5 μl，dNTP(10 mmol)2 μl，25 mmol MgCl22 μl，Taq DNA聚合酶 0.5 μl，cDNA 模板 2 μl，10 × PCR 緩沖液 2.5 μl，總反應(yīng)體系25 μl。PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件:90℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入循環(huán)，95℃變性45 s，分別在蛋白聚糖:55℃;可聚蛋白聚糖酶-1:60℃;可聚蛋白聚糖酶-2:60℃;18 S mRNA:57℃的溫度退火45 s后，72℃延伸45 s的條件下循環(huán)擴(kuò)增，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃再延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外分析儀下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物特異條帶。產(chǎn)物經(jīng)凝膠成像及分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測(cè)定條帶的A值。以18 S作內(nèi)參照，用蛋白聚糖、可聚蛋白聚糖酶-1和可聚蛋白聚糖酶-2條帶的A值與18S條帶的A比較，進(jìn)行目的基因表達(dá)的半定量分析。

表1 半定量RT-PCR引物系列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析(LSD)。

2 結(jié)果

2.1 GAG結(jié)果 比較5組細(xì)胞釋放入培養(yǎng)液的GAG百分比，其中B組最高(56.4±2.2)%，顯著高于C組(t=6.54，P＜0.01)、D 組(t=5.34，P ＜0.01)、E 組(t=5.34，P ＜0.01)和 A組(兔血清對(duì)照組)(t=6.24，P＜0.01);C組其次(40.4±2.2)%，明顯高于D組(23.4±2.4)%(t=4.98，P＜0.01)和E組(11.4±2.4)%(t=5.98，P＜0.01)，但與A組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;A組(42.4±2.2)% 明顯高于D組和E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01);E組最低，與D組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示氨基葡萄糖能夠抑制IL-1β對(duì)OA軟骨細(xì)胞蛋白聚糖分解的促進(jìn)作用，對(duì)OA軟骨細(xì)胞蛋白聚糖的降解亦有明顯的抑制作用。

2.2 培養(yǎng)液中3B3片段含量的比較 見(jiàn)表2。E組最高、D組相對(duì)較高，與A組、B組相比差異顯著(P均＜0.01);其次是C組，與A組、B組相比差異顯著(P均＜0.05);B組、A組最低，二者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 培養(yǎng)液中5D4片段含量的比較 見(jiàn)表2。B組最高，A組和C組次之，其次是D組，E組最低。B組與E組、D組、A組、C組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中 B組與 E組、D組相比(P均＜0.01);B組與A組、C組相比(P均＜0.05);A組與C組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);E組與D組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 不同培養(yǎng)條件軟骨3B3片段、5D4片段含量比較(±s ，n=3)

表2 不同培養(yǎng)條件軟骨3B3片段、5D4片段含量比較(±s ，n=3)

與A組、B組比較:1)P＜0.01;2)P＜0.05;與B組相比:3)P＜0.05

組別 3B3片段 5D4片段A組 120.43±5.11 209.43±0.0213)B組 123.23±4.12 251.32±0.120 C組 144.32±5.152) 216.43±0.1133)D組 164.23±4.171) 190.45±0.0921)E組 204.14±5.181) 160.52±0.0811)

2.4 蛋白聚糖、MMPs-1及MMPs-3 mRNA的表達(dá) 各組軟骨細(xì)胞蛋白聚糖、可聚蛋白聚糖酶-1、可聚蛋白聚糖酶-2 mRNA相對(duì)含量(即與18 S mRNA A值的比值)的比較(見(jiàn)表3)。半定量RT-PCR顯示氨基葡萄糖加藥組的蛋白聚糖mRNA表達(dá)的均值均較對(duì)照組明顯增高，其中與B組相比(P均＜0.01)，D組、E組與 A組相比(P＜0.01)，C組與 A組相比(P＜0.05)，隨氨基葡萄糖濃度的增加，蛋白聚糖mRNA表達(dá)逐漸增加;氨基葡萄糖加藥組的可聚蛋白聚糖酶-1、可聚蛋白聚糖酶-2 mRNA表達(dá)均較對(duì)照組明顯降低，其中與B組相比(P均＜0.01)，E組、D組與A組(對(duì)照組1)相比(P＜0.01)，C組與A組相比(P＜0.05)，隨氨基葡萄糖濃度的增加，可聚蛋白聚糖酶-1、可聚蛋白聚糖酶-2 mRNA的表達(dá)逐漸降低。

表3 不同培養(yǎng)條件軟骨細(xì)胞蛋白聚糖、可聚蛋白聚糖酶-1和可聚蛋白聚糖酶-2表達(dá)強(qiáng)度比較(±s ，n=3)

表3 不同培養(yǎng)條件軟骨細(xì)胞蛋白聚糖、可聚蛋白聚糖酶-1和可聚蛋白聚糖酶-2表達(dá)強(qiáng)度比較(±s ，n=3)

組別 蛋白聚糖 可聚蛋白聚糖酶-1 可聚蛋白聚糖酶-2 A組 0.22±0.112) 0.673±0.0212) 0.422±0.1372)B組 0.12±0.121) 0.832±0.1201) 0.782±0.1141)C組 0.35±0.153) 0.568±0.1133) 0.331±0.1273)D組 0.84±0.16 0.420±0.092 0.232±0.007 E組1.25±0.18 0.280±0.081 0.101±0.007

與E組、D組、C組比較:1)P＜0.01;與E組、D組比較:2)P＜0.01;與A組相比:3)P＜0.05

3 討論

OA是以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的常見(jiàn)疾病，軟骨細(xì)胞功能異常導(dǎo)致蛋白聚糖的代謝紊亂是OA的特征之一〔1〕。既往OA被認(rèn)為是一種非炎癥性的關(guān)節(jié)病變，但近年來(lái)大量的研究證實(shí)異常炎癥反應(yīng)在OA的發(fā)病中起著重要的作用。已經(jīng)證實(shí)，在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)中有過(guò)度的前炎性細(xì)胞因子如IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)和炎性介質(zhì)NO等生成〔8〕。其中IL-1β是存在于OA軟骨及滑液中的重要炎性細(xì)胞因子，不僅抑制軟骨基質(zhì)的合成，加速膠原和蛋白多糖的降解，而且誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡，已作為人工制作OA模型的誘導(dǎo)劑而廣泛使用〔9，10〕。氨基葡萄糖是治療OA的特異性藥物，有研究顯示氨基葡萄糖能夠刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生蛋白多糖，參與透明質(zhì)酸和多聚氨基葡萄糖的合成，同時(shí)具有抑制肉芽組織增生、血管滲出和細(xì)胞游離，有效改善關(guān)節(jié)炎的癥狀〔11〕。

蛋白聚糖是一種復(fù)雜的蛋白多糖大分子，它的主體結(jié)構(gòu)主要由核心蛋白、3個(gè)球狀結(jié)構(gòu)域和1個(gè)球間區(qū)組成;核心蛋白由大量的GAG鏈包繞，GAG占蛋白聚糖分子量的80%～90%〔12〕，是蛋白聚糖的決定性功能基團(tuán)。研究認(rèn)為，GAG更適合作為蛋白聚糖轉(zhuǎn)化的參考數(shù)值，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚糖解聚、降解，游離的GAG增多等，使得蛋白聚糖失去其正常結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)軟骨細(xì)胞功能異常導(dǎo)致蛋白聚糖的降解增多時(shí)，過(guò)多的GAG可被釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中，故檢測(cè)細(xì)胞外GAG的含量可反映蛋白聚糖的總體代謝情況〔13〕。OA動(dòng)物模型關(guān)節(jié)液中GAG水平異常升高并與病程相關(guān)，且經(jīng)IL-1β作用于OA患者的軟骨細(xì)胞后，釋放入培養(yǎng)液中GAG的百分比明顯升高，提示細(xì)胞因子IL-1β可促進(jìn)蛋白聚糖的降解〔14〕。本研究結(jié)果驗(yàn)證了IL-1β的確可促進(jìn)蛋白聚糖的降解，并隨氨基葡萄糖濃度的增加，釋放入培養(yǎng)液中GAG的百分比逐漸降低。說(shuō)明氨基葡萄糖能夠抑制IL-1β對(duì)OA軟骨細(xì)胞蛋白聚糖分解的促進(jìn)作用，對(duì)OA軟骨細(xì)胞蛋白聚糖的降解亦有明顯的抑制作用。

當(dāng)軟骨細(xì)胞功能異常時(shí)，過(guò)多的蛋白聚糖酶及多種基質(zhì)金屬蛋白酶可作用于蛋白聚糖的不同部位，產(chǎn)生不同的代謝片段。目前針對(duì)于蛋白聚糖不同代謝片段的Mab廣泛用于蛋白聚糖的代謝研究，它可特異性地與蛋白聚糖的不同代謝片段結(jié)合，從而了解蛋白聚糖的代謝狀況〔15〕。Mab-3B3和5D4是分別識(shí)別CS和KS兩種GAG的單克隆抗體，其中Mab-3B3可檢測(cè)CS區(qū)末端天然的CS鏈，它所檢測(cè)的3B3片段大量見(jiàn)于胎兒軟骨及新合成的軟骨中，正常成熟的軟骨中幾乎檢測(cè)不到，故研究者認(rèn)為3B3是蛋白聚糖合成的標(biāo)記物。研究發(fā)現(xiàn)，在早期兔的OA模型中，關(guān)節(jié)液中3B3片段明顯升高，而晚期卻檢測(cè)不到，故認(rèn)為OA病變?cè)缙诘鞍拙厶呛铣苫钴S可能有利于修復(fù)和重建損傷的軟骨組織〔16〕。Mab-5D4可與蛋白聚糖的核心蛋白區(qū)KS鏈中重復(fù)出現(xiàn)的硫酸化六糖結(jié)合，可以檢測(cè)蛋白聚糖代謝所產(chǎn)生的KS片段，是蛋白聚糖降解的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明氨基葡萄糖不但能夠抑制OA患者蛋白聚糖的降解，而且能夠抑制IL-1β誘導(dǎo)的OA患者蛋白聚糖的降解，同時(shí)可增加蛋白聚糖合成，達(dá)到治療OA的目的。但I(xiàn)L-1β只具有促進(jìn)蛋白聚糖降解的作用，而無(wú)促進(jìn)蛋白聚糖合成的作用。

關(guān)節(jié)軟骨破壞有兩種途徑:一種是內(nèi)在途徑，即軟骨細(xì)胞自身降解軟骨細(xì)胞外基質(zhì);另一種是外在途徑，如炎癥滑膜、血管翳組織、浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞，通過(guò)關(guān)節(jié)滑液破壞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)。兩種途徑中酶性降解細(xì)胞外基質(zhì)是軟骨破壞的主要原因〔17〕。除基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)外，可聚蛋白聚糖酶-1和可聚蛋白聚糖酶-2是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的兩種重要的蛋白聚糖降解酶，在OA患者的關(guān)節(jié)軟骨中，這兩種酶的mRNA表達(dá)均明顯增高〔18〕。不同于MMPs作用于蛋白聚糖核心蛋白球間區(qū)域(IGD)Asn341 Phe342位點(diǎn)，可聚蛋白聚糖酶的作用部位則是蛋白聚糖核心蛋白IGD區(qū)域 Glu373 Ala374位點(diǎn)，而且該位點(diǎn)被認(rèn)為是蛋白聚糖降解的關(guān)鍵部位〔19〕。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，Aggrecanase介導(dǎo)的蛋白聚糖降解在OA軟骨退變中首先發(fā)生，依賴MMPs的蛋白聚糖核心蛋白的降解開(kāi)始大約3 w后才能檢測(cè)到，與此同時(shí)，膠原的降解才開(kāi)始發(fā)生〔20〕。并且同時(shí)抑制可聚蛋白聚糖酶-1和可聚蛋白聚糖酶-2能防止關(guān)節(jié)軟骨的蛋白聚糖降解，據(jù)此相信，Aggrecanase介導(dǎo)的蛋白聚糖降解，在軟骨細(xì)胞外基質(zhì)代謝平衡異常的退變破壞過(guò)程中不僅起重要作用，而且可能是事件的始發(fā)者〔18〕。本研究觀察到代表核心蛋白降解的5D4片段明顯升高，推測(cè)這兩種酶可作用于人軟骨蛋白聚糖的核心蛋白區(qū)，導(dǎo)致蛋白聚糖的降解。

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