周惠瓊 張 清 葉 彬 孫曉萱 楊文芳

?

競爭性ELISA法測定軟骨細(xì)胞蛋白聚糖代謝片段的可行性分析

周惠瓊 張 清 葉 彬 孫曉萱 楊文芳

目的 本研究探討競爭性ELISA法測定軟骨細(xì)胞蛋白聚糖代謝片段的可行性，為蛋白聚糖相關(guān)研究提供一個(gè)新的方法。方法 利用單克隆抗體(Mab-5D4)通過競爭性ELISA 法檢測體外培養(yǎng)的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞蛋白聚糖的代謝片段，摸索最佳實(shí)驗(yàn)條件，計(jì)算本方法的板間差異和板內(nèi)差異，同時(shí)通過DMMB分光光度法測定蛋白聚糖的代謝物糖胺聚糖(GAG)，并比較它們的相關(guān)性。結(jié)果 競爭性ELISA法測定蛋白聚糖5D4片段方法的板間差異為10.38%，板內(nèi)差異為3.91%，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)上清液5D4片段的濃度明顯高于對照組(328.22ng/ml vs 184.61ng/ml,t=5.67，P=0.001)。與常規(guī)分光光度法測定蛋白聚糖的代謝物GAG有較好的相關(guān)性(r=0.453～0.579，P=0.001)。結(jié)論 競爭性ELISA法測定蛋白聚糖代謝產(chǎn)物方法簡便，重復(fù)性好，可應(yīng)用于蛋白聚糖代謝的相關(guān)研究。

蛋白聚糖 ELISA 軟骨細(xì)胞

軟骨是關(guān)節(jié)的主要結(jié)構(gòu)之一，蛋白聚糖(aggrecan)與Ⅱ型膠原同為關(guān)節(jié)軟骨的主要成分，其中蛋白聚糖異常代謝是軟骨病變的主要表現(xiàn)，常見的關(guān)節(jié)炎如骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)都存在蛋白聚糖的異常代謝。既往蛋白聚糖的代謝研究常采用DMMB分光光度法測定蛋白聚糖的代謝物糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)來代表蛋白聚糖的降解，影響因素多，結(jié)果不穩(wěn)定。近年來發(fā)現(xiàn)用針對蛋白聚糖代謝片段的單克隆抗體(Mab)通過ELISA法來檢測蛋白聚糖的不同代謝片段，方法簡單，重復(fù)性好，有一定的應(yīng)用價(jià)值[1,2]。其中Mab-5D4 為一種識(shí)別蛋白聚糖代謝片段的單克隆抗體，它可與蛋白聚糖核心蛋白區(qū)的硫酸角質(zhì)素(keratinsulphate，KS)鏈中重復(fù)出現(xiàn)的硫化七糖結(jié)合，所檢測產(chǎn)物5D4片段是蛋白聚糖降解的標(biāo)志物[3]。本實(shí)驗(yàn)利用Mab-5D4通過競爭性ELISA 法檢測體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞蛋白聚糖的代謝片段，以其摸索出一種簡便而又實(shí)用的檢測蛋白聚糖代謝片段的方法，應(yīng)用于蛋白聚糖相關(guān)的科研和臨床研究。

材料與方法

1.主要試劑：牛軟骨提取的蛋白聚糖(Sigma公司),Ⅱ型膠原酶(Sigma公司)，二甲基亞甲藍(lán)(1,9-dimethylmethylene blue，DMMB，Serva公司)，硫酸軟骨素A(Seikagaku Kogyo公司)，細(xì)胞培養(yǎng)液達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)基(DMEM)/F12(Invitrogen公司)，軟骨細(xì)胞源自新西蘭大白兔(西澳大學(xué)動(dòng)物中心提供)，Mab-5D4(Mdbioproducts公司)。本研究通過中日友好醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.軟骨細(xì)胞培養(yǎng)：軟骨細(xì)胞取自新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)的股骨髁。軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[4]。細(xì)胞單層融合后按1∶2傳代，第1代軟骨細(xì)胞采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞存活率，選擇細(xì)胞存活率均>95%的適當(dāng)實(shí)驗(yàn)濃度做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。將第1代軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)入12孔的組織細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)為1.5×105/L，培養(yǎng)48 h后，為去除小牛血清對GAG和蛋白聚糖分解片段測定的干擾，用不含小牛血清的培養(yǎng)液洗滌2次。此后的培養(yǎng)均采用無小牛血清的培養(yǎng)液。將軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、TNF-α組，每組設(shè)3孔，TNF-α組為培養(yǎng)液中含10 ng/ml的TNF-α,對照組為培養(yǎng)液中無任何刺激因子。所有細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)8天，每2天更換收集培養(yǎng)液并儲(chǔ)存于-20℃冰箱待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)用。

3.競爭性ELISA法檢測蛋白聚糖的代謝片段[5]：為了去除邊沿效應(yīng)，每次實(shí)驗(yàn)只利用標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)板居中的60孔，舍棄周邊孔。標(biāo)準(zhǔn)參照物為軟骨素酶處理后的蛋白多糖(protroglycan treatment with chondroitinase,PG CASE)。(1)確定Mab-5D4在ELISA中的最佳作用濃度: 將購置的原液Mab-5D4按1/500、1/5000、1/10000、1/20000、1/40000及1/80000稀釋，以吸光度約為1，斜率最大處的Mab-5D4稀釋度為最佳工作濃度。(2)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：每一酶標(biāo)板均建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的稀釋濃度為：PG CASE: 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9ng/ml。復(fù)孔檢測，并設(shè)空白對照及非特異結(jié)合孔。(3)檢測本實(shí)驗(yàn)中ELISA方法的穩(wěn)定性：通過測定本實(shí)驗(yàn)方法的酶標(biāo)板板間差異(inter-run variability)和板內(nèi)差異(intra-run variability)，用以下的公式計(jì)算板間和板內(nèi)的變異系數(shù)(coefficient of variance, CV)，了解本實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性。CV=標(biāo)準(zhǔn)差/均數(shù)(A值)×100%。板內(nèi)的變異系數(shù)：同一份待測的培養(yǎng)液，在同一酶標(biāo)板同時(shí)測定6次，復(fù)孔測定，共12孔。取A值計(jì)算CV。板間的變異系數(shù)：同一份待測培養(yǎng)液在不同的酶標(biāo)板中重復(fù)測定6次，復(fù)孔檢測，取A值計(jì)算CV。

4.測定細(xì)胞培養(yǎng)液中蛋白聚糖5D4代謝片段: 用125ng/ml的PG CASE包被酶聯(lián)反應(yīng)板,100微升/孔, 4℃濕盒過夜。棄包被液,200μl封閉液37℃封閉1h,洗滌液洗滌3次。用稀釋液配制10個(gè)1∶2連續(xù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗原(PG CASE)溶液；取150μl的Mab-5D4(1∶200000稀釋),加到圓底的微量滴定板的每個(gè)孔中,再加入150μl不同稀釋倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)抗原。 同時(shí)以相同方法混合Mab-5D4和待測培養(yǎng)液(均適當(dāng)比例稀釋),混勻溶液,37℃放置60min。將100μl的標(biāo)準(zhǔn)混合液及待測混合液轉(zhuǎn)移到抗原包被板中,37℃作用1h，洗滌3次。加入酶標(biāo)Ⅱ抗(羊抗鼠IgG)到各反應(yīng)孔中,100微升/孔,37℃作用60min，洗滌3次。將底物加入到各反應(yīng)孔中,100微升/孔, 37℃作用90min。加入50微升/孔的終止液。

5.軟骨細(xì)胞及培養(yǎng)液中GAG的測定：GAG的含量采用DMMB分光光度法測定，體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)過程中，GAG釋放入培養(yǎng)液中的水平代表蛋白聚糖的降解程度，釋放入培養(yǎng)液中的GAG越多．表明蛋白聚糖的降解越明顯。本實(shí)驗(yàn)采用GAG釋放至培養(yǎng)液中的量占總體GAG(細(xì)胞內(nèi)+培養(yǎng)液)的百分率表示蛋白聚糖的降解。

結(jié) 果

根據(jù)不同Mab-5D4抗體濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，1/200000Mab-5D4稀釋度為本研究ELISA法最佳工作濃度。應(yīng)用競爭性ELISA法檢測蛋白聚糖代謝片段5D4的結(jié)果穩(wěn)定性，板內(nèi)差異見表1，板間差異CV的結(jié)果見表2。

表1 同一份待測培養(yǎng)液在同一酶標(biāo)板重復(fù)測定6次(共12孔)的A值

表2 同一份待測培養(yǎng)液在不同酶標(biāo)板重復(fù)測定6次(共12孔)的A值

圖1 ELISA法測定培養(yǎng)液中5D4片段含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

ELISA法測定培養(yǎng)液中5D4片段含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(以其中一酶標(biāo)板為例，圖1)。培養(yǎng)8天時(shí)培養(yǎng)液中5D4片段總含量測定，試驗(yàn)組培養(yǎng)液中5D4片段的含量與對照組比較明顯增多(328.22ng/ml vs 184.61ng/ml,t=5.67，P=0.001)。培養(yǎng)不同時(shí)間(2～8天)時(shí)，培養(yǎng)液中兩組細(xì)胞5D4片段釋放均逐漸減少，培養(yǎng)的前3個(gè)時(shí)間段(2、4和6天)， TNF-α組釋放的5D4片段均比對照組明顯增多(P=0.000)。而培養(yǎng)的最后兩天，兩組細(xì)胞釋放的5D4片段無區(qū)別。

表3 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間段培養(yǎng)液中5D4含量及GAG釋放的百分率

#組別1、2、3、4分別代表培養(yǎng)的時(shí)間段：2、4、6及8天。與對照組比較，*P=0.000

軟骨細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間段(2～8天)時(shí)GAG釋放入培養(yǎng)液的百分率在培養(yǎng)的第1時(shí)段(2天)，TNF-α組軟骨細(xì)胞GAG釋放高于對照組(61.47%±12.90% vs 34.54%±6.43%,P=0.000),其余3個(gè)時(shí)間段兩組無差別,詳見表3。軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的不同時(shí)間段GAG的釋放與5D4片段檢測的結(jié)果呈明顯正相關(guān)(r=0.453～0.579，P=0.000)。

討 論

軟骨是關(guān)節(jié)的重要組成部分，軟骨細(xì)胞的主要功能是分泌細(xì)胞外基質(zhì)，維持軟骨的正常代謝從而維持關(guān)節(jié)的完整性和穩(wěn)定性。蛋白聚糖是軟骨細(xì)胞的產(chǎn)物之一，與Ⅱ型膠原同為關(guān)節(jié)軟骨的主要構(gòu)成成分。20世紀(jì)60年代，國外研究者就對蛋白聚糖異常代謝與關(guān)節(jié)疾病間的關(guān)系做了相關(guān)研究，認(rèn)為蛋白聚糖的進(jìn)行性破壞與關(guān)節(jié)病變有明顯的相關(guān)性，OA患者血清及關(guān)節(jié)液的蛋白聚糖代謝片段水平與關(guān)節(jié)的放射學(xué)改變有關(guān)，蛋白聚糖的異常代謝可望能預(yù)測關(guān)節(jié)破壞的進(jìn)程[6～8]。

蛋白聚糖的主體結(jié)構(gòu)由一個(gè)核心蛋白和3個(gè)球狀結(jié)構(gòu)域(globular domain, G1, G2, G3)組成。核心蛋白在G2和G3之間，是富含GAG側(cè)鏈的區(qū)域，GAG的主要成分是硫酸角質(zhì)素(KS)和硫酸軟骨素(chondroitin, CS)，核心蛋白的GAG區(qū)域是易受蛋白酶作用的部位，測定GAG的分泌常作為蛋白聚糖代謝的指標(biāo)。近年來，針對蛋白聚糖不同部位的Mab逐漸用于研究與關(guān)節(jié)相關(guān)的蛋白聚糖代謝[9,10]。Straglics等[11]用多種針對蛋白聚糖不同部位的Mab檢測幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液，發(fā)現(xiàn)他們的蛋白聚糖代謝模式不同于成年OA患者。

Mab-5D4 為一種識(shí)別蛋白聚糖代謝片段的單克隆抗體，它可與蛋白聚糖核心蛋白區(qū)的KS鏈中重復(fù)出現(xiàn)的硫化七糖結(jié)合，所檢測產(chǎn)物5D4片段是蛋白聚糖降解的標(biāo)志物[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的豬軟骨小體在機(jī)械性壓力作用下，5D4片段不同程度地增多，其增多的程度和蛋白聚糖代謝的標(biāo)志物GAG的變化相平行。在十字韌帶切斷的損傷性膝關(guān)節(jié)炎模型中，損傷后的第1周90%的關(guān)節(jié)積液中5D4片段明顯增多，在2～3周所有損傷關(guān)節(jié)的積液均可檢測到5D4 片段，而對側(cè)正常關(guān)節(jié)的積液中始終無5D4片段出現(xiàn)，提示急性損傷可引起蛋白聚糖的降解。

國內(nèi)有關(guān)蛋白聚糖相關(guān)研究較少，特別是應(yīng)用單克隆抗體通過ELISA法檢測蛋白聚糖代謝片段的可行性如何一直無相關(guān)報(bào)道。本研究選擇可與蛋白聚糖核心蛋白區(qū)的KS鏈結(jié)合的Mab-5D4，通過競爭性ELISA法檢測體外培養(yǎng)的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞蛋白聚糖代謝片段，計(jì)算不同酶標(biāo)板的板間和板內(nèi)的變異系數(shù)，了解本方法的板間差異和板內(nèi)差異，判斷其結(jié)果穩(wěn)定性。為了更好地區(qū)分蛋白聚糖在異常條件作用下的代謝情況,本研究選擇了常見的炎性因子TNF-α作為刺激因子,觀察軟骨細(xì)胞受刺激后蛋白聚糖的代謝情況與正常對照組的比較。

本研究結(jié)果顯示，用Mab-5D4測定蛋白聚糖代謝片段的板內(nèi)CV值為3.91%，板間CV值為10.38%，與既往的研究相似，均具有較好的穩(wěn)定性，為可以推廣應(yīng)用的范圍[5]。實(shí)驗(yàn)中TNF-α組的總體5D4片段含量明顯高于對照組，說明TNF-α可刺激軟骨細(xì)胞蛋白聚糖的分解。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)顯示用Mab-5D4測定蛋白聚糖代謝片段與GAG測定值有較好的相關(guān)性(r=0.453～0.579，P=0.001)。

在不同時(shí)間段的實(shí)驗(yàn)中，前3個(gè)時(shí)間段(2、4、6天)TNF-α組的5D4片段均明顯大于對照組，第4時(shí)間段兩組間無差別，而GAG的結(jié)果有所不同，雖然TNF-α組4個(gè)時(shí)間段的GAG結(jié)果均大于對照組，但只有第1時(shí)間段(2天)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他3個(gè)時(shí)間段僅略高于對照組。說明本實(shí)驗(yàn)所測的兩個(gè)指標(biāo)雖然都代表蛋白聚糖的降解，有一定的相關(guān)性，但它們之間還是有所差別，可能代表蛋白聚糖核心蛋白區(qū)不同部位的降解。

本研究顯示，競爭性ELISA法通過Mab-5D4測定蛋白聚糖代謝片段的方法穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，與傳統(tǒng)的蛋白聚糖代謝指標(biāo)GAG有較好的相關(guān)性，如同時(shí)應(yīng)用兩種方法可望能更好地進(jìn)行蛋白聚糖代謝的相關(guān)研究。

1 周惠瓊，張奉春.抗蛋白聚糖單克隆抗體在關(guān)節(jié)軟骨代謝研究中的應(yīng)用[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2007，11(8):503-505

2 Hughes CE, Caterson B, Fosang AJ,etal.Monoclonal antibodies that specifically recognize neoepitope sequences generated by aggrecanase and matrix metalloproteinase cleavage of aggrecan: application to catabolism in situ and in vitro[J]. Biochem J,1995,305(3):799-804

3 Hayes AJ, Hughes CE, Caterson B. Antibodies and immunohistochemistry in extracellular matrix research[J].Methods, 2008,45(1):10-21

4 Guerne PA, Sublet A, Lotz M.Growth factor responsiveness of human articular chondrocytes: distinct profiles in primary chondrocytes, subcultured chondrocytes, and fibroblasts[J].J Cell Physiol, 1994,158(3):476-484

5 Chan SS, Kent GN, Will RK. A sensitive assay for the measurement of serum chondroitin sulfate 3B3(-) epitope levels in human rheumatic diseases[J]. Clin Exp Rheumatol,2001, 19(5):533-540

6 Struglics A, Hansson M, Lohmander LS. Human aggrecanasegenerated synovial fluid fragment levels are elevated directly after knee injuries due to proteolysis both in the inter globular and chondroitin sulfate domains[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2011, 19(8):1047-1057

7 Staffan L, Martin E, André S,etal.Association between synovial fluid levels of aggrecan ARGS fragments and radiographic progression in knee osteoarthritis[J]. Arthritis Research & Therapy, 2010, 12(6):R2308 Eya Kalai, Afef Bahlous, Nadine Charni,etal. Association of serum levels of aggrecan ARGS, NITEGE fragments and radiologic knee osteoarthritis in Tunisian patients[J]. Joint Bone Spine,2012,79(6):610-615

9 Melrose J, Isaacs MD, Smith SM,etal.Chondroitin sulphate and heparan sulphate sulphation motifs and their proteoglycans are involved in articular cartilage formation during human foetal knee joint development[J].Histochem Cell Biol, 2012,138(3):461-475

10 Lotz M,Martel-Pelletier J,Christiansen C,etal. Value of biomarkers in osteoarthritis: current statusand perspectives[J]. Ann Rheum Dis,2013,72:1756-1763

11 Struglics A,Lohmander LS,Last K,etal. Aggrecanase cleavage in juvenile idiopathic arthritis patientsIs minimally detected in the aggrecanInterglobular domainbut robust at the aggrecan C-terminus[J]. Arthritis & Rheumatism, 2012,64(12):4151-4161

(修回日期：2015-02-26)

Feasibility of ELISA for the Measurement of 5D4 Fragments in Culturedarticular Chondrocytes.

ZhouHuiqiong,ZhangQing,YeBin,etal.

DepartmentofRheumatology,TheFirstAffiliatedHospitalofGeneralHospitalofPLA,Beijing100048,China

Objective Monoclonal antibodies (Mab) of 5D4 which specifically against structural carbohydrate epitopes on the KS of aggrecan have been produced and used to detect the fragment of aggrecan which represents the abnormal metabolism of articular cartilage.Methods Articular chondrocytes were cultured with stimulated subject of TNF-α for up to 8 days.Aggrecan catabolic fragments in medium were measured by ELISA using Mab-5D4. The inter-run variability and intra-run variability were calculated. The GAG was measured by using a modification of a 1,9-dimethylmethylene blue spectrophotometric assay (DMMB) and the correlations with the results of ELISA were detected.Results The coefficient of variance of inter-run and intra-run of ELISA were10.38% and 3.91%, respectively. Fragments of 5D4 in medium of TNF-αgroups significantly increase than control (328.22ng/ml vs 184.61ng/ml,t=5.67，P=0.001).There were good correlations between the results of ELISA and GAG detected by DMMB assay(r=0.453-0.579，P=0.001). Conclusion The consistency and repeatability of ELISA to detect the fragments of 5D4 released by chondrocytes is acceptable. The method can be used in the study of metabolism of aggrecan.

Chondrocyte;ELISA;Aggrecan

首都臨床特色應(yīng)用研究基金資助項(xiàng)目(Z121107001012019)

100048 北京，解放軍總醫(yī)院附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕科(周惠瓊、張清)；100029 北京，中日友好醫(yī)院風(fēng)濕免疫科(周惠瓊、葉彬、孫曉萱、楊文芳)

周惠瓊，教授，主任醫(yī)師，電子信箱：13901188181@163.com

R3

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.015

2015-01-27)