田嘉銘， 饒 娜， 信秀玲， 王書華

(河北北方學院藥學系，河北張家口075000)

大黃酚和大黃素甲醚為蓼科植物大黃中的兩種有效成分單體，屬蒽醌類化合物，大黃酚具有止咳、抗菌、止血、降血糖、收縮血管、降低血管脆性的作用，能消除體內(nèi)自由基，有明顯的抗衰老和促進學習記憶的作用［1-4］，大黃素甲醚對大腸桿菌等26種細菌有抑制作用，對人體宮頸癌Hela細胞生長具有較強的抑制作用［5］。

在植物體內(nèi)，大黃酚和大黃素甲醚常共同存在，結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 大黃酚和大黃素甲醚結(jié)構(gòu)圖

兩種化合物結(jié)構(gòu)相似，酸性與極性相近，使分離工作極為困難。大黃酚、大黃素甲醚的分離純化方法有柱色譜法、薄層色譜法、高效毛細管電泳法等，但操作繁瑣、制備量低。

制備高效液相色譜 (PHPLC)法已成為當今高效分離與純化中藥有效成分的重要技術(shù)手段，在制備高純度生物活性物質(zhì)時，操作簡單，制備量大［6］，而用PHPLC分離純化大黃酚和大黃素甲醚的研究尚未見報道。本實驗建立了PHPLC分離、純化大黃中大黃酚和大黃素甲醚的分析方法，為大黃酚和大黃素甲醚的實驗室大規(guī)模制備提供了實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑 大黃購于張家口市張垣中藥飲片有限公司，甘肅，批號為090801;大黃酚對照品，批號為110796-200310，大黃素甲醚對照品，批號為0758-9803，中國藥品生物制品檢定所;甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。

1.2 儀器 Agilent 1100 HPLC(美國安捷倫公司);Agilent1200 Preparative HPLC(美國安捷倫公司);MODUL YOD-230真空冷凍干燥系統(tǒng) (美國熱電公司);ME-SE Series電子天平 (德國賽多利斯公司);SGW X-4顯微熔點儀(上海精密科學儀器有限公司);U-3900紫外可見分光光度計 (日本日立公司);BRUKER AVANCE-400兆液體譜儀(德國布魯克公司);LD-04高速中藥粉碎機 (浙江省溫嶺市大海藥材機械廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃中大黃酚和大黃素甲醚粗產(chǎn)品的提取 按文獻［7］并改進，稱取干燥粉碎的大黃粉末 (過60目篩)400.0 g置于2 L圓底燒瓶中，加入適量的石油醚，常壓恒溫 (62～63℃)回流1 h，趁熱過濾，濾渣真空干燥(50℃，0.08 MPa)。稱真空干燥的大黃粉末200.0 g，加15%的硫酸溶液400 mL，攪拌均勻，密封5 d，加入三氯甲烷1 000 mL回流提取2次，每次3 h(溫度61.7～63.0℃)，稍冷后抽濾，棄去殘渣，將三氯甲烷提取液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，用蒸餾水洗滌三氯甲烷提取液。將三氯甲烷提取液置于1 000 mL分液漏斗中，用5%碳酸氫鈉、5%碳酸鈉、5%氫氧化鈉依次萃取，直至三氯甲烷溶液的顏色變?yōu)辄S色 (除去大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素等)。將含有大黃酚和大黃素甲醚的三氯甲烷溶液減壓濃縮 (42～43℃，0.08 MPa)至200 m L，用5%氫氧化鈉溶液反復萃取三氯甲烷溶液中的大黃酚和大黃素甲醚，同時用高效液相色譜法定量，跟蹤檢測大黃酚和大黃素甲醚的萃取過程。合并幾次萃取的5%氫氧化鈉溶液，滴加鹽酸至pH值為3，減壓濃縮該溶液至有沉淀析出，抽濾，用蒸餾水洗滌沉淀，低溫高速離心 (1 000 r/min，8 min)，用AgNO3隨時監(jiān)測上清液中的氯離子，直至氯離子消失。沉淀物自然干燥得大黃酚和大黃素甲醚混合物粗品。

2.2 HPLC法測定大黃酚和大黃素甲醚［8-9］

2.2.1 色譜條件 Hypersil ODS2色譜柱 (4.6 mm×150 mm，5.0μm)，柱溫35℃，進樣量20μL，流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液 (85∶15)，體積流量1 mL/min，檢測波長254 nm。

2.2.2 標準曲線的制作 精密稱取大黃酚、大黃素甲醚對照品1.0 mg，甲醇溶解、定容，配成0.10 mg/mL的標準溶液。吸取標準溶液分別配成質(zhì)量濃度為1.0、5.0、10.0、15．0、20.0μg/mL的標準溶液，按色譜條件進樣，以質(zhì)量濃度對峰面積進行線性回歸，得標準曲線方程為:大黃酚Y=3.431X－3.987，r=0.999 8，線性范圍為1.0～20.0 μg/mL。大黃素甲醚:Y=1.703X+11．839，r=0.999 6，線性范圍為1.0～20.0μg/mL。

2.2.3 供試品的定量測定 采用外標法。按2.2.1項色譜條件測定，將大黃酚和大黃素甲醚峰面積代入標準曲線方程，得大黃酚和大黃素甲醚質(zhì)量濃度，計算含有量。

2.3 PHPLC分離純化大黃酚和大黃素甲醚

2.3.1 檢測波長的選擇 大黃酚、大黃素甲醚對照品，甲醇溶解，經(jīng)U-3900紫外分光光度計在200～450 nm掃描，結(jié)果大黃酚、大黃素甲醚均在254 nm有吸收，且靈敏度較高。因此，選擇254 nm為檢測波長。

2.3.2 制備液相色譜條件 色譜柱為ZORBAX SB-C18(21.2 mm×250 mm，7μm)，流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液 (85∶15)，柱溫30℃，進樣量8 mL，體積流量20 mL/min，檢測波長254 nm，基于峰進行餾分收集，最小閾值為2.0 mAU。

2.3.3 制備大黃酚和大黃素甲醚 用適量流動相溶解2.1項的大黃酚與大黃素甲醚粗品，過0.45μm微孔濾膜。按制備色譜條件進樣，根據(jù)制備色譜圖收集大黃酚與大黃素甲醚餾分，餾分經(jīng)減壓濃縮，至有少量晶體析出時，真空冷凍干燥，得大黃酚1.780 2 g，大黃素甲醚0.980 2 g。見圖2。

2.4 制備所得大黃酚和大黃素甲醚純度檢測 對照品定性，見圖3、4，將制備所得大黃酚和大黃素甲醚按2.2.1項色譜條件下進行定量測定，采用峰面積歸一化法，大黃酚的純度為98.1%(雜質(zhì)峰面積為25.7，大黃酚峰面積為1 323)，外標法定量，測得大黃酚質(zhì)量分數(shù)為98.8%(n=3)，大黃素甲醚的純度為98.3%(雜質(zhì)峰面積之和為19.3，大黃素甲醚峰面積為1 149.8)，外標法定量，測得大黃素甲醚質(zhì)量分數(shù)為98.7%(n=3)。

圖2 大黃酚和大黃素甲醚制備液相色譜圖

圖3 大黃酚HPLC圖

2.5 大黃酚和大黃素甲醚結(jié)構(gòu)鑒定

所得單體大黃酚為黃色晶體，熔點儀未校正，mp 184～185℃，與對照品混合熔點不下降。1H-NMR進行結(jié)構(gòu)鑒定，1H-NMR(DMSO-d6)δ:12.17(1H，s， － OH)，12.07(1H，s， － OH)，7.87(1H，d，C5-H)，7.72(1H，dd，C6-H)，7.70(1H，s，C4-H)，7.32(1H，dd，C7-H)，7.15(1H，s，C2-H)，2.51(3H，s，Ar-CH3)。數(shù)據(jù)與文獻［10］報道一致。

所得單體大黃素甲醚為橙紅色晶體，熔點儀未校正，mp 203～204℃，與對照品混合熔點不下降。1H-NMR進行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果為:1H-NMR(DMSO-d6)δ:12.30(1H，s， － OH)，12.29(1H，s， － OH)，7.35(1H，d，C5-H)，7.58(1H，d，C4-H)，7.69(1H，d，C7-H)，7.05(1H，s，C2-H)，3.96(3H，s，OCH3)，2.46(3H，s，Ar－CH3)。數(shù)據(jù)與文獻 ［11］報道一致。

圖4 大黃素甲醚HPLC圖

3 討論

3.1 提取條件的選擇 按文獻［7］提取時，提取物冷凍干燥時總會有油狀物存在，干燥不完全，考慮可能是揮發(fā)油類物質(zhì)，經(jīng)查文獻，大黃酚和大黃素甲醚在石油醚中幾乎不溶，為此我們選擇先用石油醚對大黃進行脫脂處理，在用5%氫氧化鈉萃取大黃酚和大黃素甲醚過程中，先對三氯甲烷溶液減壓濃縮，節(jié)省了氫氧化鈉的使用量，同時采用HPLC實時檢測大黃酚和大黃素甲醚的萃取過程，比文獻［7］中報道的單純靠顏色判斷萃取過程更加準確可靠。

3.2 流動相和體積流量的選擇 大黃酚和大黃素甲醚均具有一定的極性和酸性，考察了不同比例的甲醇-1%醋酸，乙腈-1%醋酸，甲醇-0.1%磷酸，乙腈-0.1%磷酸對分離效果的影響，結(jié)果表明，同一條件下甲醇-0.1%磷酸 (85∶15)作為流動相時，大黃酚和大黃素甲醚可以達到基線分離，出峰時間短 (20 min)。在流動相選定的條件下，考察了不同體積流量 (10～25 mL/min)對分離大黃酚和大黃素甲醚的影響，當體積流量小于20 m L/min時，雖然大黃酚和大黃素甲醚能很好的分離，但保留時間延長，所需流動相的量增加，造成試劑的浪費;而增大體積流量雖然能夠縮短保留時間，但體積流量大于20 mL/min時，大黃酚和大黃素甲醚分離效果不佳，本實驗選擇體積流量為20 mL/min。

3.3 進樣量的選擇 在樣品質(zhì)量濃度一定條件下，考察了不同進樣體積(4～10 mL)對大黃酚和大黃素甲醚分離度的影響。實驗結(jié)果表明，小于8 mL進樣體積范圍內(nèi)，分離度較好，但流動相用量太大，造成浪費;進樣體積大于8 mL時，大黃酚和大黃素甲醚重疊嚴重，無法選取合適的餾分收集位置，使產(chǎn)品純度無法保證。當進樣量為8 mL時，保證了流出曲線的峰對稱性。因此，本實驗選擇進樣量為8 mL。

與薄層色譜法、高效毛細管電泳法［12-13］相比較，應(yīng)用PHPLC法分離制備大黃酚和大黃素甲醚，進樣量大，出峰時間短，樣品純度高、操作簡便，可用于實驗室大規(guī)模制取大黃酚和大黃素甲醚對照品。

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