周蘭英，蔣樂龍，李定梅，閻 青，于紅纓，姚志軍，向開敏

(1.懷化醫(yī)學高等專科學校，湖南懷化418000;2.懷化市第一人民醫(yī)院，湖南懷化418000;3.中南大學湘雅三醫(yī)院，湖南長沙410013)

乙型肝炎 (hepatitis B，HB)是由乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus，HBV)感染機體后所引起的疾病。乙型肝炎是一個世界性公共衛(wèi)生問題，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性感染者，我國的慢性乙肝患者約9 300萬人［1］。已有的大量研究證實，慢性乙肝與多種慢性肝病、肝硬化和肝細胞癌的發(fā)生有關，嚴重危害人類的身體健康［2－4］，有關慢性乙肝的致病機制和防治方法的研究是感染性疾病研究中的重點之一［5］。天然免疫是機體抵抗病毒感染的重要防線，在乙型肝炎病毒感染時同樣發(fā)揮著重要作用［6－7］。而 Toll樣受體 (Toll-like receptor，TLR)既是天然免疫的重要組成分子，也是聯(lián)系天然免疫與適應性免疫的重要紐帶［8］。本研究擬通過檢測慢性乙肝患者外周血單個核細胞TLR3的表達以及血清中相關細胞因子含量，同時比較患者體內(nèi)HBV的DNA復制水平，明確乙型肝炎病毒感染與TLR3表達之間的聯(lián)系，為探索乙肝病毒的致病機制提供新的實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2011-03—2012-03在中南大學湘雅三醫(yī)院就診的慢性乙肝患者25例，根據(jù)肝穿刺病理結果及其他臨床資料，參照慢性乙型肝炎防治指南(2010 年版)確診［9］，輕度12 例，中度 10 例，重度3例。其中男性20例，女性5例，年齡范圍:21～53歲，平均年齡34.3歲。根據(jù)患者血清HBeAg的狀態(tài)和HBV拷貝數(shù)將上述患者分為復制活躍組(HBeAg陽性，且 HBV DNA拷貝數(shù) ＞1×105copies/Ml，n=15)和復制不活躍組(HBeAg陰性，且HBV DNA 拷貝數(shù)介于1×103～1×105copies/mL，n=10)。同時選擇來院體檢的健康志愿者25例作為健康對照組，其中男性20例，女性5例，年齡范圍:20～54歲，平均年齡30.6歲。血清HBsAg及HBV DNA均為陰性，無心、肝、腎、消化道、代謝異常和神經(jīng)等系統(tǒng)疾病史。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑:血清HBV DNA檢測試劑盒(廣州達安基因股份有限公司);TNF-α、IFN-β ELISA檢測試劑盒(晶美公司);Ficoll淋巴細胞分離液(Sigma公司);Trizol及反轉錄試劑盒(Promega公司)，Taq DNA Polymerase(TaKaRa公司)，引物合成由上海生工完成;小鼠抗人TLR3熒光抗體以及同型對照抗體(eBioscience公司)，破膜劑(Fix＆Perm)(Beckman公司)。小鼠抗人TLR3抗體、小鼠抗人β-actin多克隆抗體、兔抗小鼠抗體及ECL試劑盒(Santa Cruz公司)。

1.2.2 標本采集與保存:所有對象均于清晨采集空腹靜脈血5 mL，其中3 mL全血加入肝素鈉抗凝管，應用Ficoll淋巴細胞分離液分離PBMC;另2 mL全血不抗凝，在小試管中自然凝血后收集血清，取100 μL血清在30 min內(nèi)進行HBV DNA檢測，其余血清于－70℃保存待用。

1.2.3 血清HBV DNA檢測:采用熒光定量PCR法，按照試劑盒操作說明進行，該試劑盒的最低敏感度為1×103copies/mL，本研究中慢性乙肝患者的血清HBV DNA拷貝數(shù)均高于此數(shù)值?；颊哐錒BeAg的情況依據(jù)門診檢驗結果。

1.2.4 TLR3 mRNA表達檢測:將采集到的PBMC用PBS洗滌1次后，調(diào)細胞濃度至106個/mL，取1 mL細胞懸液以Trizol法抽提總RNA，按照反轉錄試劑盒說明將RNA反轉錄為cDNA，以得到的cDNA為模板進行PCR擴增，TLR3擴增引物:上游引物:5'-GCTGGAAAATCTCCAAGAGC-3'，下游引物:5'-CTTCCAATTGCGTGAAAACA-3';擴增片段長度為159 bp;以β-actin為內(nèi)對照，擴增引物:上游引物:5'-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3'，下游引物:5'-GT CAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3';擴增片段長度為106 bp。擴增后通過凝膠成像，經(jīng)全自動凝膠成像分析儀掃描DNA條帶灰度值，軟件分析條帶灰度比值，以β-actin的mRNA為參照，計算TLR3 mRNA的相對表達量。

1.2.5 流式細胞術檢測TLR3表達:將采集到的PBMC用PBS洗滌1次后，調(diào)細胞濃度至106個/mL，取500 μL，加入破膜劑孵育20 min后，再加入 FITCTLR3單抗在4℃下避光繼續(xù)孵育20 min，PBS洗滌1次，重懸細胞，0.5%多聚甲醛固定后，流式細胞儀檢測。

1.2.6 免疫印跡檢測TLR3表達:將剩余的PBMC用細胞裂解液裂解，BCA法測定裂解液總蛋白濃度，將裂解液蛋白樣品(50 μg總蛋白/泳道)經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后，轉移至PVDF膜;分別加入抗TLR3及抗 β-actin抗體(一抗)在37℃孵育2 h，PBS-T洗膜4次;辣根過氧化酶標記的兔抗小鼠IgG抗體(二抗)與膜孵育1 h，PBS-T洗膜4次，ECL試劑盒檢測印跡蛋白，X線片掃描后，用圖像分析軟件分析。

1.2.7 細胞因子檢測:按照相關ELISA試劑盒說明書進行操作，每份血清設復孔，450 nm波長下酶標儀測定樣本的吸光度值(A)，通過標準曲線計算樣本濃度。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組PBMC中TLR3 mRNA的表達

復制不活躍組以及復制活躍組慢性乙肝患者PBMC的TLR3 mRNA表達水平均顯著低于健康對照組(P＜0.05);且HBV復制活躍組的TLR3 mRNA表達水平進一步低于HBV復制不活躍組(P＜0.05)(圖1，表1)。

2.2 流式細胞術檢測各組PBMC中TLR3的表達

兩組慢性乙肝患者PBMC中TLR3+細胞百分數(shù)均顯著低于健康對照組(P＜0.05);且HBV復制活躍組的TLR3+細胞百分數(shù)進一步低于HBV復制不活躍組(P＜0.05)(表2)。

圖1 RT-PCR檢測TLR3 mRNA的表達Fig 1 TLR3 mRNA expression detected by RT-PCR

2.3 免疫印跡檢測各組PBMC中TLR3的表達

慢性乙肝患者的TLR3表達水平低于健康對照組，且HBV復制活躍組的TLR2表達水平進一步低于HBV復制不活躍組，這與流式細胞檢測結果一致(圖2)。

2.4 ELISA檢測各組血清中相關細胞因子的水平

慢性乙肝患者血清中的TNF-α及IFN-β水平均顯著低于健康對照組(P＜0.05)，且HBV復制活躍組進一步低于HBV復制不活躍組(P＜0.05)(表3)。

表1 PBMC中TLR3 mRNA表達Table 1 The TLR3 mRNA expression in PBMC

表2 PBMC中TLR3的表達Table 2 The TLR3 expression in PBMC

圖2 免疫印跡檢測PBMC中TLR3蛋白的表達Fig 2 The Western-blotting results of TLR3

表3 外周血TNF-α及IFN-β含量(ng/L)Table 3 Concentration of TNF-α and IFN-β in peripheral blood(ng/L)

3 討論

慢性乙型肝炎的致病機制一直是研究者關注的熱點，在乙型性肝炎病毒感染過程中，宿主的抗病毒免疫功能狀態(tài)將顯著影響疾病的發(fā)展，同時也是影響乙肝預后的一個重要的方面［10］。機體對病毒的有效識別和清除依賴于天然免疫和獲得性免疫的相互補充和協(xié)作，Toll樣受體家族(TLRs)是能夠識別病原體相關分子模式從而快速啟動天然免疫反應，并影響獲得性免疫反應的發(fā)生和發(fā)展方向的關鍵性分子［11］。TLRs為Ι型跨膜信號蛋白受體在進化上高度保守，不同的TLR有不同的細胞分布，而且可識別并區(qū)分不同類型的病原體。其中TLR3主要分布于體內(nèi)的單核細胞和樹突狀細胞，在上述細胞的抗原提呈過程中發(fā)揮重要作用，TLR3可識別病毒在宿主體內(nèi)復制時產(chǎn)生的雙鏈RNA(dsRNA)，而且與乙肝病毒的感染和致病密切相關［12］。

本研究結果顯示，慢性乙肝患者外周血單個核細胞中TLR3的mRNA以及蛋白表達水平均受到抑制，而且在病毒復制活躍的個體TLR3的抑制更為明顯;同時血清中與病毒免疫密切相關的細胞因子TNF-α和IFN-β的含量也表現(xiàn)出與TLR3相一致的趨勢，即在乙肝患者體內(nèi)水平下降，且降低幅度與病毒復制活性相關。這些結果強烈提示:TLR3的表達與慢性乙肝患者體內(nèi)的病毒復制直接相關，乙肝病毒感染可下調(diào)TLR3的表達，這很可能是乙肝病毒抑制宿主的抗病毒免疫，導致疾病發(fā)生的重要機制。

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