王美琴，盧海波，趙立娟，郝曉娟

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.祁縣峪口鄉(xiāng)人民政府，山西祁縣030900）

隨著社會生產(chǎn)力的發(fā)展，人們對生活環(huán)境質(zhì)量愈來愈關(guān)注，對綠色食品的要求亦愈迫切，這就不可避免地要求限制化學(xué)農(nóng)藥的使用量及應(yīng)用范圍。近年來，應(yīng)用微生物代替（或部分代替）化肥和農(nóng)藥，越來越受到各國政府及學(xué)者的高度重視[1]。植物內(nèi)生菌與寄主植物在長期共同進化過程中形成了密切的相互關(guān)系，且生存微環(huán)境穩(wěn)定，成為化肥、農(nóng)藥和其他微生態(tài)制劑的最佳競爭者，其合理應(yīng)用將減少化學(xué)農(nóng)藥造成的環(huán)境污染、提高農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性和有利于保持生態(tài)平衡[2-4]。據(jù)報道，植物內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物中具有促進植物生長的物質(zhì)如植物生長素、乙烯、赤霉素和細胞分裂素等，可直接促進植物生長。Sturz等[5]對從馬鈴薯和紅三葉草中分離的內(nèi)生細菌研究發(fā)現(xiàn)，有21%對寄主生長有促進作用，13%對寄主生長表現(xiàn)為抑制作用。Tien等[6]就內(nèi)生細菌對植物促生作用的機制進行研究，結(jié)果表明，內(nèi)生細菌可以通過生物固氮或產(chǎn)生植物激素直接促進植物生長；Lazarovits等[7]證明，內(nèi)生細菌可以通過誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生植物激素；何紅等[8]在研究內(nèi)生枯草芽孢桿菌BS-1，BS-2菌株對辣椒和白菜促生作用機制中也發(fā)現(xiàn)，用菌株培養(yǎng)液浸種后，導(dǎo)致植株體內(nèi)生長素（IAA）、赤霉素（ GA3）和玉米素（ ZR4）等植物內(nèi)源激素含量增加，脫落酸（ABA）含量下降。Xu等[9-10]研究表明，內(nèi)生細菌還可以通過改變寄主植物對霜凍等有害環(huán)境條件及有害病原生物的敏感性或防止植物病害的發(fā)生等促進植物生長。

為了研究山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病害生防作用課題組分離篩選出的對核桃腐爛病菌具有拮抗作用的內(nèi)生菌株HT3是否具有促生功能，本試驗研究了該菌株代謝產(chǎn)物對番茄、黃瓜種子萌發(fā)和幼苗生長的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

細菌培養(yǎng)用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA），即蛋白胨7.5 g，牛肉浸膏3.0 g，葡萄糖2.5 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.0～7.2。 不加瓊脂為液體培養(yǎng)液（NB）。

內(nèi)生菌HT3是由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室從健康的核桃枝條中分離篩選出的拮抗菌株。供試作物種子為番茄（海紅一號）和黃瓜（津研四號）。

1.2 內(nèi)生菌HT3培養(yǎng)濾液的制備

核桃內(nèi)生菌HT3在NA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，取兩環(huán)接種于裝液量為100 mL、體積為250 mL的錐形瓶，置于28℃，160 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h即為菌株培養(yǎng)液，再置于18 000 r/min的離心機上離心15 min，其上清液用直徑0.45μm過濾膜過濾后，過濾液在4℃的條件下進行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 內(nèi)生菌株HT3培養(yǎng)濾液對番茄、黃瓜種子萌發(fā)的影響

將1.2制備的培養(yǎng)濾液原液用無菌水分別稀釋為 1.25，2，5，10，20，100倍。 將黃瓜、番茄種子分別浸泡在不同倍數(shù)的稀釋濾液中12，24 h后，放在鋪有濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，每皿放20粒種子，每個處理3次重復(fù)，在25℃的恒溫箱中培養(yǎng)，每天按時用無菌水補足水分以保持濾紙潮濕。3 d后觀察和記錄種子的發(fā)芽率以及胚芽生長量。以空白培養(yǎng)液的離心上清液作為對照[11-12]。

1.4 內(nèi)生菌株HT3培養(yǎng)濾液對黃瓜、番茄幼苗生長的影響

分別用稀釋10倍的HT3培養(yǎng)濾液、NB培養(yǎng)液和無菌水浸泡黃瓜和番茄種子12 h，然后播種于無菌土花盆中，每盆播種15粒，每處理重復(fù)3次，置于人工氣候箱中培養(yǎng)（白天25℃，晚上20℃），出苗后調(diào)查出苗率。每盆選大小一致的10株苗（其余的剔除），于播種后20 d分別測定其株高、莖粗、根長及植株的鮮質(zhì)量，植株干質(zhì)量于80℃烘干3 h后稱量[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌HT3培養(yǎng)濾液對番茄、黃瓜種子發(fā)芽率的影響

試驗結(jié)果表明，種子的發(fā)芽率與培養(yǎng)濾液的稀釋倍數(shù)、浸泡時間沒有相關(guān)性，在所測試的稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)，種子的萌發(fā)率與對照相比，差異不顯著。

2.2 內(nèi)生菌HT3培養(yǎng)濾液對番茄、黃瓜種子胚芽生長量的影響

由圖1可知，用不同稀釋倍數(shù)的菌株HT3培養(yǎng)濾液處理的番茄、黃瓜種子都能夠正常發(fā)芽生長，但不同稀釋倍數(shù)對胚芽的生長量影響不同。HT3培養(yǎng)濾液在稀釋5～100倍之間對番茄、黃瓜種子的萌發(fā)具有明顯地促生作用，在這一稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)胚芽的生長量明顯大于對照，當(dāng)培養(yǎng)濾液稀釋10倍時，番茄和黃瓜種子胚芽的生長量分別為對照的215%和142%；當(dāng)稀釋倍數(shù)小于5倍時，對胚芽的生長出現(xiàn)了抑制作用，并隨著稀釋倍數(shù)的降低抑制作用愈來愈強。當(dāng)稀釋1.25倍時，種子不萌發(fā)。

2.3 番茄種子在內(nèi)生菌HT3培養(yǎng)濾液中浸泡不同時間后胚芽和胚根的生長量

從圖2可以看出，內(nèi)生菌HT3稀釋10倍的培養(yǎng)濾液浸泡番茄種子后，胚根和胚芽的生長量均顯著大于對照，種子浸泡12 h后，無論是胚芽的生長量還是胚根的生長量都明顯高于浸泡24 h。12 h處理的種子胚芽長度為31.5 mm，24 h處理的種子胚芽長度為29.3 mm。

2.4 內(nèi)生菌HT3培養(yǎng)濾液對番茄和黃瓜種子幼苗的促生作用

從表1可以看出，稀釋10倍的HT3培養(yǎng)濾液浸種處理對幼苗生長有明顯的促生作用，與對照相比差異顯著，增加了番茄和黃瓜幼苗的平均鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，且與對照相比，增加均達到130%以上；番茄和黃瓜幼苗的平均株高與對照相比，分別增加31.66%和68.02%，平均莖粗與對照相比，分別增加86.54%和69.35%。結(jié)果還表明，空白NB培養(yǎng)液浸種對番茄和黃瓜幼苗的生長雖然與菌株培養(yǎng)濾液相比差距大，但與無菌水相比均有不同程度的促進作用，可見空白NB培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分也可促進種子的萌發(fā)。

表1 內(nèi)生菌HT3培養(yǎng)濾液對番茄和黃瓜幼苗的促生作用

3 結(jié)論與討論

關(guān)于植物內(nèi)生菌的促生作用國內(nèi)已有許多相關(guān)的報道，涉及的植物有農(nóng)作物、蔬菜及水果等各個領(lǐng)域[11-16]。本試驗結(jié)果表明，核桃內(nèi)生菌HT3菌株對番茄和黃瓜種子的萌發(fā)和幼苗的生長都具有明顯促生作用。菌株培養(yǎng)濾液處理的番茄和黃瓜植株苗比清水處理的健壯、葉片大、葉色濃綠、莖稈粗、根毛長。菌液處理的種子萌發(fā)后胚芽和胚根的生長量都明顯高于對照，但不同稀釋倍數(shù)的菌株培養(yǎng)濾液對種子的促生作用是不同的。當(dāng)稀釋倍數(shù)太低時反而對種子萌發(fā)有抑制現(xiàn)象，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物——生長激素類物質(zhì)高造成的。所以，在利用內(nèi)生菌作為生物肥料時，應(yīng)將內(nèi)生細菌的有效含量控制在一定范圍內(nèi)。同時結(jié)果顯示，內(nèi)生菌的培養(yǎng)液對種子浸泡12 h后的促生作用更好。種子的發(fā)芽率與是否經(jīng)過培養(yǎng)液的處理之間沒有相關(guān)性，本試驗中所使用的內(nèi)生菌在稀釋倍數(shù)大時，對番茄和黃瓜種子沒有明顯的毒害作用。關(guān)于菌株HT3的生防作用方面還未見報道，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院核桃內(nèi)生菌對植物病害生防作用課題組前期研究表明，該菌株對多種病原菌具有抑制作用，有關(guān)該菌株的其他方面如生物活性物質(zhì)的主要成分及分子結(jié)構(gòu)、在田間的生防作用及促生功能受環(huán)境因素的影響等還有待于研究。本研究為具有防病、促生、固氮等多功能菌株的開發(fā)應(yīng)用和植物病害的生物防治提供了有用的資源。

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