黃希艷，李 倩，朱陵群

我國每年約有200萬新發(fā)卒中病例，死于卒中人數(shù)約有150萬人。在卒中疾病中，缺血性腦卒中占60%～80%［1］，因此探討缺血性腦卒中發(fā)病機制及藥物保護問題顯得尤為重要。片仔癀方由三七、天然麝香、天然牛黃、蛇膽等天然藥材組成［2］。具有清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛的顯著功效［3］。本課題為了進一步了解片仔癀在腦缺血后腦保護的作用，探討其恢復機制，建立大腦中動脈阻塞（MCAO）大鼠模型，給予片仔癀干預，觀察其ZO－1、MMP－9蛋白及mRNA表達的變化，為臨床治療提供理論及實踐基礎。

1 材料與方法

1．1 動物分組 成年SD大鼠35只，雄性，體重260g±20g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，許可證編號：SCXK－（軍）2007－004。

大鼠隨機分為手術組和假手術組（正常組）。手術組根據(jù)術后Longa評分將納入標準者隨機分組，模型組（生理鹽水組）、片仔癀大劑量組、片仔癀中劑量組、片仔癀小劑量組腦、得生組、尼莫地平組，每組5只。

1．2 藥品與試劑 片仔癀膠囊（漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，批號：0711050；）；尼莫地平片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，國藥準字：H20003010，產(chǎn)品批號：BJ00604，規(guī)格：每片含30mg）；腦得生（廣東國醫(yī)堂制藥股份有限公司，批號110101，糖衣片，片芯重0．3，每盒72片）；一抗：MMP－9為羊多克隆抗體（santa cruz，貨號：SC－6841）；ZO－1為兔多克隆抗體（santa cruz，貨號：SC－1084）；Actin兔多克隆抗體（santa cruz，貨號：sc－1616）；二抗：HRP標羊抗兔IgG 二抗（santa cruz，貨號：sc－2004）、HRP標兔抗羊IgG 二抗（santacruz，貨號：sc－2768）；RNA 抽提試劑盒：尚柏生物醫(yī)學（北京）有限公司。

1．3 MCAO模型的制備 參考文獻［4，5］采用改良 Zea－Longa方法制備。于清醒后2h參照Longa 5級標準［4］對神經(jīng)功能評分。

1．4 給藥方法 按大鼠與人體表面積等效劑量折算，片仔癀實驗小劑量、中劑量、大劑量分別設定為每日0．054g／kg、0．162 g／kg、0．486g／kg，腦得生為0．486g／kg，尼莫地平為0．010 8 g／kg。以上各組均于造模前灌胃給藥3d，第4天灌胃給藥后30min造模，造模后給藥觀察至第7天，取材。

1．5 標本制備 分別于MCAO術后第3天取各組大鼠5只，經(jīng)3．5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速斷頭處死大鼠，立即取右側梗死區(qū)大腦皮層（約120mg），放入凍存管后置于液氮罐中保存，以備行western blot及實時熒光PCR檢測。

1．6 MMP－9、ZO－1蛋白測定 每組組織各取20mg左右置入預冷的研缽中，倒入液氮，迅速研磨成粉末狀，加入1mL總蛋白提取液，冰上裂解20min，離心后取上清液即為總蛋白；BCA法樣品蛋白濃度測定后5×buffer緩沖液在100℃沸水中煮沸10min；轉膜；5%脫脂奶粉封閉，37℃搖床孵育1h；一抗用含5%脫脂奶粉稀釋1∶200，二抗1∶3000；ECL曝光：使用ECL化學發(fā)光顯色液（SUNBIO）。

1．7 MMP－9、ZO－1mRNA測定 應用總RNA提取試劑盒，用一步法RQ－PCR試劑盒（Promega Corporation）進行檢測。ZO－1、MMP－9引物由尚柏生物醫(yī)學（北京）有限公司使用Primer express 3．0軟件設計并合成上下游引物，選用actin作為內(nèi)參校正樣品的RNA含量。

2 結 果

2．1 片仔癀對ZO－1、MMP－9蛋白表達的影響與假手術組相比，模型組ZO－1表達顯著降低（P＜0．01），與模型組相比，片仔癀大劑量組、尼莫地平組及腦得生組ZO－1表達顯著升高（P＜0．05）；片仔癀大劑量組較片仔癀小劑量組有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。詳見表1。

表1 ZO－1蛋白表達的變化（±s）

表1 ZO－1蛋白表達的變化（±s）

與假手術組相比，1）P＜0．01；與模型組相比，2）P＜0．05；與片仔癀小劑量組相比，3）P＜0．05

組別 n ZO－1蛋白假手術組 5 0．344±0．0822）模型組 5 0．170±0．0401）片仔癀大組 5 0．283±0．0112）3）片仔癀中組 5 0．253±0．069片仔癀小組 5 0．240±0．134尼莫地平組 5 0．294±0．1012）腦得生組 5 0．295±0．0782）

1）為國家科技重大專項基金課題（重大新藥創(chuàng)制，No：2008ZX09202）

用Western Blot方法檢測片仔癀對MCAO大鼠術后MMP－9表達的影響，與假手術組相比，模型組MMP－9表達顯著升高（P＜0．01），與模型組相比，片仔癀大劑量組、尼莫地平組及腦得生組MMP－9表達顯著降低（P＜0．05）；片仔癀大劑量組較片仔癀小劑量組有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。詳見表2。

表2 MMP－9蛋白的表達變化OD值分析（±s）

表2 MMP－9蛋白的表達變化OD值分析（±s）

與假手術組相比，1）P＜0．01；與模型組相比，2）P＜0．05，3）P＜0．01；與片仔癀小劑量組相比，4）P＜0．05

組別 n MMP－9蛋白假手術組5 0．323±0．098模型組 5 0．532±0．0711）片仔癀大組 5 0．394±0．0602）4）片仔癀中組 5 0．477±0．068片仔癀小組 5 0．466±0．084尼莫地平組 5 0．324±0．1583）腦得生組 5 0．380±0．1152）

2．2 片仔癀對ZO－1、MMP－9mRNA表達的影響 用RQ－PCR方法檢測片仔癀對 MCAO大鼠術后ZO－1mRNA表達的影響，與假手術組比較，模型組ZO－1mRNA表達顯著降低（P＜0．01），與模型組比較，片仔癀大劑量組、中劑量組、尼莫地平組及腦得生組較模型組顯著升高（P＜0．01）。詳見表3。

表3 ZO－1mRNA表達變化（±s，2－△△Ct）

表3 ZO－1mRNA表達變化（±s，2－△△Ct）

與假手術組相比，1）P＜0．01；與模型組相比，2）P＜0．01

組別 n ZO－1mRNA假手術組5 3．002±0．059模型組 5 1．094±0．0681）片仔癀大組 5 2．696±0．0332）片仔癀中組 5 2．296±0．1352）片仔癀小組 5 1．654±0．074尼莫地平組 5 2．827±0．0192）腦得生組 5 2．538±0．0722）

用RQ－PCR方法檢測片仔癀對 MCAO大鼠術后 MMP－9mRNA表達的影響，與假手術比較，模型組 MMP－9mRNA表達顯著升高（P＜0．01），與模型組比較，片仔癀大劑量組、中劑量組、小劑量組、尼莫地平組及腦得生組較模型組顯著降低（P＜0．05）。詳見表4。

表4 MMP－9mRNA表達變化（±s，2－△△Ct）

表4 MMP－9mRNA表達變化（±s，2－△△Ct）

與假手術組相比，1）P＜0．01；與模型組相比，2）P＜0．05

組別 n MMP－9mRNA假手術組5 0．436±0．018模型組 5 0．970±0．0141）片仔癀大組 5 0．680±0．0232）片仔癀中組 5 0．800±0．0343片仔癀小組 5 0．920±0．0302）尼莫地平組 5 0．476±0．0242）腦得生組 5 0．591±0．0182）

3 討 論

缺血性中風一直是臨床上的治療難題，血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的破壞既是腦缺血損傷的結果，又是進一步導致腦損傷的關鍵環(huán)節(jié)［6］，而BBB通透性的改變與緊密連接（tight junction，TJ）的主要成分ZO－1分布及缺失密切相關［7］。同時MMP－9在血腦屏障的損傷中扮演著重要作用［8，9］。在正常狀態(tài)下，MMP－9被控制在較低水平，不會過度激活。但在缺血性腦損傷發(fā)生時，其活性明顯增加，促使血腦屏障微血管基膜遭到破壞，導致繼發(fā)性腦水腫和腦出血等一系列生理病理改變。

片仔癀具有清熱解毒、活血祛瘀之功效，運用于治療缺血性中風取得了很好的療效。本實驗結果提示，片仔癀藥物組ZO－1蛋白及mRNA的表達較模型組增高，腦缺血發(fā)生后應用片仔癀可上調(diào)ZO－1蛋白及mRNA的表達，同時片仔癀藥物組MMP－9蛋白及mRNA的表達較模型組下降，腦缺血發(fā)生后應用片仔癀可下調(diào)MMP－9蛋白及mRNA的表達，這可能是片仔癀促進腦梗死后功能恢復的可能機制之一，可為腦保護劑研制提供新的思路和方法。

［1］ 中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會腦血管病學指南撰寫組［J］．中國急性缺血性腦卒中診經(jīng)科雜志，2010，43（2）：146－153．

［2］ 劉叢盛．片仔癀藥理及臨床應用綜述［J］．醫(yī)藥世界，2006（7）：64－66．

［3］ 徐武英，閻庚飛．片仔癀治療病毒性肝炎的療效觀察［J］．黑龍江醫(yī)藥，2003，16（6）：542－543．

［4］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomyin rats［J］．Stroke，1989，20（1）：84－91．

［5］ 徐叔云，卞如濂，陳修．藥理實驗方法學［M］．第3版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1066－1067．

［6］ Allen CL，Bayraktutan U．Oxidative stress and its role in the pathogenesis of ischaemic stroke［J］．Int J Stroke，2009，4（6）：461－470．

［7］ Jiao H，Wan g Z，Liu Y，et al．Specific role of tight junction proteins Claudin－5，occludin，and ZO－1of the blood brain barrier in a focal cerebral ischemic insult［J］．J Mol Neurosci，2011，4（22）：130－139．

［8］ 毛玲，查運紅，梅元武．基質(zhì)金屬蛋白酶－9與腦缺血血腦屏障損傷的關系［J］．國際神經(jīng)病學神經(jīng)外科學雜志，2006，33（1）：96－98．

［9］ 李小記，王航輝，米志寬．L－硝基－精氨酸甲酯對大鼠腦缺血再灌注損傷后血腦屏障功能和基質(zhì)金屬蛋白酶－9表達的影響［J］．陜西醫(yī)學雜志，2009，38（5）：537－540．