陳廷速，盧文祥，韋勤麗，黃玉溢，張金蓮 ，李 松，王倫旺，汪 茜 ，譚裕模，譚宏偉

（1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，南寧 530007；2.廣西柳城縣甘蔗研究中心，柳城545200；3.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院資源與環(huán)境研究所，南寧 530007；4.廣西甘蔗研究所，南寧 530007；）

叢枝菌根（arbuscular mycorrhizae，AM）真菌是一類(lèi)廣泛分布于土壤中的有益微生物，能夠侵染80%以上的陸生植物。AM真菌在提高植物對(duì)土壤水分、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)（尤其是P）的吸收，增強(qiáng)其對(duì)多種生物脅迫和非生物脅迫（如干旱）的抗性，維持植物多樣性和土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性都發(fā)揮作用［1－2］。通過(guò)菌根和根際微生物來(lái)改善土壤生態(tài)，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，降低化肥的施用量，減緩對(duì)環(huán)境的污染，已成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究的熱點(diǎn)之一。

甘蔗是我國(guó)重要的糖料作物，80%左右種植在旱坡地，由于多年的連作和過(guò)度依賴(lài)化肥來(lái)提高產(chǎn)量，已經(jīng)普遍引起土壤惡化，土壤微生物群落失衡。甘蔗根際土壤具有豐富的AM真菌資源［3］，但甘蔗根系和根際土壤中的AM真菌群落結(jié)構(gòu)尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。本文利用Nested PCR技術(shù)對(duì)有多年宿根的甘蔗根系及根際土壤的AM真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為深入開(kāi)展甘蔗AM真菌的基礎(chǔ)研究及AM菌劑在甘蔗大田上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2013年1月16日從廣西柳城縣甘蔗研究中心試驗(yàn)基地采集有6年宿根年限甘蔗 （品種為柳城0348，親本來(lái)源：CP72-1210×ROC22）的甘蔗根系及根際土壤。按照甘蔗根際土壤采集方法[3]，采集10～20 cm土層土樣約2 kg，同時(shí)收集植株的根系。將土樣于陰涼處自然風(fēng)干后，置于陰涼處保存?zhèn)溆?。根樣洗凈后，置?80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 根樣DNA的提取 參考董秀麗等[4]方法，并略修改。取洗凈的根樣1～2 g，剪成0.5 cm長(zhǎng)的碎段，用超純水漂洗3次，TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）漂洗1次，將其放入無(wú)菌的2 mL離心管中，加入500 μL TE緩沖液，沸水浴10 min，冰浴5 min，12000 r/min離心5 min，吸取上清液到新的離心管中，置于-20℃保存，備用。

1.2.2 土樣 DNA的提取 用試劑盒：FastDNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals）（Catalog#6560-200）提取土樣DNA，置于-20℃保存，備用。

1.2.3 Nested-PCR 將土壤DNA直接作模板,根樣DNA稀釋100倍后作模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增（eppendorf AG 6325）。 PCR所使用的引物為 ：GeoA2：5'-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3'；Geo11：5'-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC -3'；NS31 -GC：5'-TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC -3'；AM1：5'-GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA-3'；Glol：5'-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3'[5-9]。 PCR 反應(yīng)參考龍良鯤等[10]。

第一次PCR：所用引物為真菌18S rDNA通用引物GeoA2和Geo11。反應(yīng)體系總體積為25 μL，其中2×Reaction Mix 12.5 μL （Golden Easy PCR System，TIANGEN），Golden DNA Polymerase （2.5 U/μL）0.2 μL，GeoA2（10 μmol/L）1.0 μL，Geo11（10 μmol/L）1.0 μL，模板 DNA 2.0 μL，ddH2O 7.5 μL。 反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃ 4 min；94℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。 第二次 PCR： 將第一次 PCR 產(chǎn)物 1∶100稀釋后作模板進(jìn)行，所用引物為NS31-GC和AM1，反應(yīng)體系同上。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃2 min；94℃45 s，65℃ 1 min，72℃ 45 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。 第三次 PCR：將第二次 PCR 產(chǎn)物 1∶100稀釋后作模板進(jìn)行，所用引物為NS31-GC和Glol，反應(yīng)體系總體積為50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃ 2 min；94℃ 45 s，55℃1 min，72℃ 45 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。

取PCR產(chǎn)物各5 μL，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) （DYY-7C型電泳儀，北京六一儀器廠(chǎng)），在A(yíng)lpha Innotech/Fluor Chem SP成像系統(tǒng)觀(guān)察。

1.2.4 DGGE分析 取以根系及土壤DNA為模板，以NS31-GC/Glol為引物的PCR產(chǎn)物45μL，用基因突變檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad公司）進(jìn)行DGGE分析，膠濃度為8%的丙烯酰胺（丙烯酰胺︰雙丙烯酰胺=37.5∶1），變性劑范圍為20%～50%（100%的變性劑為40%甲酰胺，7M尿素）。電泳：150 V，4 h。染色：用SYBR Green染色（遮光）45 min后，在A(yíng)lpha Innotech/Fluor Chem SP成像系統(tǒng)下觀(guān)察。

圖1 Nested PCR擴(kuò)增

圖2 根系及土壤的DGGE圖譜

2 結(jié)果與分析

2.1 Nested PCR

通過(guò)第一次PCR產(chǎn)物，在土壤樣品中檢測(cè)到一條目標(biāo)帶，但不清晰，從根系擴(kuò)增產(chǎn)物中未檢測(cè)到目標(biāo)帶。第二次PCR，從土壤樣品中得到大量的目標(biāo)產(chǎn)物（0.55 kb），但在根系樣品擴(kuò)增產(chǎn)物中仍未檢測(cè)到目標(biāo)產(chǎn)物。根系和土壤的第三次PCR產(chǎn)物中，都檢測(cè)到目標(biāo)產(chǎn)物（0.23 kb）（圖 1）。

2.2 DGGE分析

取土壤和根系樣品的第三次Nested PCR產(chǎn)物，進(jìn)行DGGE分析，結(jié)果出現(xiàn)21條帶（圖2）。土壤和根系樣品的DGGE譜帶具有明顯差異，土壤樣品中出現(xiàn)19條帶，而根系僅僅出現(xiàn)6條帶，兩者相同的帶數(shù)有4條 （S9/R1、S10/R2、S14/R3 和 S15/R4）， 其中土壤樣品的特有條帶為 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S11、S12、S13、S16、S17、S18和S19，根系樣品的特有條帶為R5和R6。表明在這塊6年宿根甘蔗的土壤中，AM種群較多，根系和土壤有4種相同的AM菌種群結(jié)構(gòu)。

3 討論

叢枝菌根真菌能與陸地上的80%以上植物共生，并能促進(jìn)植物生長(zhǎng)。不同種類(lèi)的AM真菌可同時(shí)出現(xiàn)在同種植物的根系中，但不同種屬的AM真菌菌絲差異卻很難區(qū)別，因此，對(duì)AM真菌的鑒定在一定程度上限制了對(duì)土壤及根系中AM真菌群落結(jié)構(gòu)的研究。已經(jīng)有160種AM真菌根據(jù)孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定（http://invam.caf.wvu.edu）。然而，在自然界，即使是同一種AM真菌的孢子，其形態(tài)結(jié)構(gòu)也存在差異，另外，許多AM真菌也沒(méi)有孢子[11]。因此，利用分子生物學(xué)技術(shù)研究田間AM真菌群落結(jié)構(gòu)非常必要。

DGGE技術(shù)近年來(lái)廣泛應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域。由于Nested PCR對(duì)AM真菌DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，能從微量DNA中擴(kuò)增出目標(biāo)片段。為了從根系和土壤中獲得特異性的AM真菌片段，本研究共進(jìn)行了3次PCR，在第二次PCR中，以AM真菌特異性引物AM1將AM真菌DNA的特異片段進(jìn)行擴(kuò)增。在本DGGE結(jié)果中，根系和土壤樣品中都有多條帶出現(xiàn)，說(shuō)明引物NS31-GC/Glol能在一定范圍內(nèi)對(duì)AM真菌的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。本研究用的實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源于具有6年宿根的甘蔗根際土壤，由于6年來(lái)一直沒(méi)有施用任何肥料包括化肥，但產(chǎn)量一直在90t/hm2；土壤樣品的理化性質(zhì)：全氮0.105%，全磷0.067%，全鉀0.854%，速效氮98 mg/kg，速效磷33 mg/kg，速效鉀212 mg/kg，有機(jī)質(zhì)20.6 g/kg，pH7.02。由于土壤生態(tài)條件好，因此，AM真菌群落構(gòu)成極豐富，在根際及土壤樣品中，總共擴(kuò)增出21條特異性的目標(biāo)片段。這和龍良鯤等[10]利用酸性土壤的根系、根際土壤及孢子做的分析得到的9條特異性的目標(biāo)片段，具有極大的差異。

土壤樣品中出現(xiàn)的DGGE條帶數(shù)多于根系樣品中的條帶數(shù)，另有2條帶僅出現(xiàn)在根系中。由于土壤中提取的AM真菌DNA只能來(lái)源于外生菌絲和孢子，孢子可以長(zhǎng)時(shí)間存活在土壤中，而外生菌絲僅能存活5～6 d[12]，因此，某菌種產(chǎn)生較多的孢子，則土樣中該菌種的條帶就很強(qiáng)，反之則很弱[10]。根系樣品有2條帶在土壤樣品中沒(méi)出現(xiàn)，可能是這種AM真菌無(wú)孢子產(chǎn)生，且外生菌絲很少。總之，實(shí)驗(yàn)樣品有豐富的AM真菌群落結(jié)構(gòu)，詳細(xì)的種群構(gòu)成有待進(jìn)一步的分析。

致謝：本研究得到廈門(mén)大學(xué)國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心和福建農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的幫助，深表感謝！同時(shí)感謝廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院李楊瑞教授和楊榮仲研究員的幫助！

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