張榮躍，單紅麗，王曉燕，尹 炯，申 科，羅志明

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開(kāi)遠(yuǎn) 661699）

甘蔗宿根矮化?。≧atoon Stunting Disease，RSD）是一種世界性的重要甘蔗病害，由一種寄居木質(zhì)部的細(xì)菌（Leifsonia xyli subsp.xyli，Lxx）引起[1]。蔗株染病后矮化，分蘗減少，蔗莖變細(xì)，節(jié)間縮短，一般減產(chǎn)12%～37%，蔗糖分降低0.5個(gè)百分點(diǎn)[2]。RSD沒(méi)有明顯的外部和內(nèi)部癥狀，從外觀難以鑒定，從而導(dǎo)致病害廣泛蔓延傳播，該病主要通過(guò)帶病蔗種和收獲、砍種刀具等傳播蔓延，且傳播性極強(qiáng)[3]，目前有效的防治方法是生產(chǎn)、繁殖和推廣脫毒健康種苗。

目前我國(guó)對(duì)甘蔗宿根矮化病菌的檢測(cè)方法主要使用PCR檢測(cè)法。由于Lxx主要寄生于蔗株維管束組織，所以PCR檢測(cè)RSD主要使用甘蔗汁，但使用甘蔗汁檢測(cè)RSD取樣和取汁程序比較繁瑣，而且榨汁過(guò)程容易污染，并且對(duì)于甘蔗苗期和組培苗等無(wú)法取汁進(jìn)行檢測(cè)，有其局限性，采用甘蔗其它部位檢測(cè)RSD可避免這些情況。本文采用常規(guī)PCR方法對(duì)甘蔗不同部位進(jìn)行了多次重復(fù)檢測(cè)，比較了甘蔗不同部位與蔗汁檢測(cè)RSD的準(zhǔn)確率，為今后使用甘蔗其它部位檢測(cè)RSD提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

供試樣品采自于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所第二科研基地脫毒種苗試驗(yàn)對(duì)照，株齡10個(gè)月，品種為粵糖93-159和ROC25，每個(gè)品種隨機(jī)取樣3株，每株取不同部位（葉片、葉鞘、莖尖、莖部組織）和蔗汁[4]，3株同一品種甘蔗的同一部位混合成一個(gè)樣品，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR檢測(cè)

1.2.1 甘蔗總DNA提取 甘蔗樣品用液氮磨成粉末，取約0.3g于1.5mL離心管中，立即加入1000 μL 65℃預(yù)熱的2%CTAB提取液，65℃水浴1h，期間顛倒離心管數(shù)次；12000r/min離心10min，取上清液，加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），充分混勻；12000r/min離心10min，取上清液，加入2/3體積的異丙醇，混勻后置于-20℃沉淀2h；12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌2次，室溫風(fēng)干，溶于30μL ddH2O中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蔗汁DNA的提取 取4mL蔗汁，12000r/min 4℃離心15min，棄上清，沉淀加300μL滅菌雙蒸水混勻；加入600μL經(jīng)65℃預(yù)熱的2%CTAB提取液，65℃水浴1h，期間顛倒離心管數(shù)次；加入600μL氯仿/異戊醇（24∶1）充分混勻，12000r/min離心10min；取上清，加入2/3體積的異丙醇，混勻后置于-20℃冰箱中沉淀2h；12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌2次，室溫風(fēng)干后，溶于30μL ddH2O中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增 引物序列采用文獻(xiàn)[5]報(bào)道的RSD病原細(xì)菌Lxx 16S～23SrDNA基因間隔區(qū)特異引物，委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為438bp。其序列為：

上游引物 Lxxl：5′-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′

下游引物 Lxx2：5′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3′

PCR 反應(yīng)體系 （20 μL） 包括 2×PCR Taq Master 8μL，Cxx1 和 Cxx2 各 0.2 μL，ddH2O 8.6μL，DNA 3μL。PCR 擴(kuò)增程序：95℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，35 個(gè)循環(huán)，72℃ 5min。

2 結(jié)果與分析

采用常規(guī)PCR檢測(cè)方法對(duì)粵糖93-159和ROC25的葉片、葉鞘、莖尖、莖部組織和蔗汁樣品分別進(jìn)行了5次重復(fù)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果（表1）表明，兩個(gè)品種葉片均只有1次檢測(cè)呈陽(yáng)性，檢出率均為20%；粵糖93-159葉鞘檢測(cè)出5次陽(yáng)性，檢出率為100%，ROC25葉鞘檢測(cè)出4次陽(yáng)性，檢出率為80%，兩個(gè)品種葉鞘平均檢出率為90%；兩個(gè)品種莖尖均檢測(cè)出2次陽(yáng)性，檢出率均為40%；莖部組織和蔗汁每次檢測(cè)均為陽(yáng)性，檢出率均為100%。

表1 甘蔗不同部位宿根矮化病菌PCR檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究使用常規(guī)PCR對(duì)甘蔗不同部位進(jìn)行Lxx檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明甘蔗不同部位均可檢測(cè)出Lxx。從檢測(cè)的重復(fù)性來(lái)看，莖部組織最好，然后依次為葉鞘和莖尖，葉片檢測(cè)的重復(fù)性最差。

趙婷婷等研究表明甘蔗不同時(shí)期的葉片和葉片的不同部位均可檢出宿根矮化病，且差異不明顯[6]。本文對(duì)國(guó)內(nèi)2個(gè)主栽品種的常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果表明，使用葉片雖可以檢測(cè)出宿根矮化病，但檢測(cè)的穩(wěn)定性卻不好，是所測(cè)甘蔗部位中重復(fù)性最差的，5次重復(fù)檢測(cè)僅有1次陽(yáng)性，檢出率僅為20%，這可能表明葉片是甘蔗所有部位中帶菌量最少的部位。本研究使用的方法對(duì)于葉片檢測(cè)重復(fù)性較差，下一步研究的重點(diǎn)將是改進(jìn)檢測(cè)方法，提高葉片檢測(cè)RSD的穩(wěn)定性。

沈萬(wàn)寬等發(fā)現(xiàn)甘蔗植株內(nèi)Lxx的帶菌量從莖基部至莖頂端逐步減少，基部維管束含菌量最大，往上逐漸減少，在葉鞘和葉片中含菌量最少，并且病原菌在甘蔗莖內(nèi)主要分布于莖節(jié)下臘粉帶對(duì)應(yīng)的木質(zhì)部中[7]，本研究中莖部組織和蔗汁每次檢測(cè)都呈陽(yáng)性，這與Lxx主要集中在莖部維管束組織中有關(guān)。本研究使用的葉片和葉鞘取自同一片葉子，但二者Lxx的檢出率卻相差很大，這可能表明葉片和葉鞘的帶菌量相差很大。

本研究所選用的兩個(gè)甘蔗品種粵糖93-159和ROC25，其中粵糖93-159被認(rèn)為是比較感RSD，而ROC25認(rèn)為是比較抗RSD的，從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，這兩個(gè)品種各部位的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯的差異。本研究為今后使用甘蔗其它部位進(jìn)行RSD檢測(cè)提供了參考，在今后的RSD檢測(cè)中，如果甘蔗莖稈榨汁困難可以使用莖部組織進(jìn)行檢測(cè)，在取莖稈困難的情況下可以使用葉鞘來(lái)檢測(cè)，而葉片則不建議用來(lái)檢測(cè)RSD。

圖1 兩個(gè)甘蔗品種不同部位RSD的5次重復(fù)檢測(cè)

[1]Davis MJ,Gillaspie AG,Harris RW,et al.Ratoon stunting disease of sugarcane:Isolation of the causal bacterium[J].Science,1980,210:1365-1367.

[2]James G.A review of ratoon stunting disease[J].International Sugar Journal,1996,98(1174):532-541.

[3]黃孟群，肖鎮(zhèn)杰.廣東甘蔗宿根矮化病調(diào)查報(bào)告[J].甘蔗糖業(yè)，1987（2）：39-40.

[4]李文鳳，盧文潔，黃應(yīng)昆，等.甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測(cè)體系的優(yōu)化與應(yīng)用[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，26（5）：598-601.

[5]Pan Y B,Grisham M P,Burner D M,et al.A polymerase chain reaction protocol for the detection of Clavibacter xyli subsp.Xyli,the causal bacterium of sugarcane ratoon stunting disease[J].Plant Disease,1998,82(3):285-290.

[6]趙婷婷，王俊剛，楊本鵬，等.甘蔗葉片宿根矮化病的PCR檢測(cè)[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（5）：870-873.

[7]沈萬(wàn)寬，周國(guó)輝，鄧海華，等.甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測(cè)及目的片段核苷酸序列分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（12）：413-416.