李文立 孫振鈞 任慧英

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院1，青島 266109)

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院2，北京 100193)

豆粕是以大豆子實為原料采用浸提法提取脂肪后，經(jīng)適當(dāng)熱處理與干燥制得的產(chǎn)品。由于其適口性好，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)43%以上，氨基酸組成比較合理，消化利用率高，是飼料工業(yè)中重要的蛋白質(zhì)飼料資源，廣泛應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)動物的配合飼料中。然而，由于豆粕中含有胰蛋白酶抑制劑(Trypsin Inhibitors，簡稱TI)、大豆凝集素、抗原蛋白、脲酶等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，尤其是TI含量高，在動物消化道中可抑制胰蛋白酶的活性，降低飼料蛋白質(zhì)消化率，引起動物胰腺肥大，影響動物的生長發(fā)育，降低了其飼用價值［1－3］。

豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子的去除方法主要包括物理、化學(xué)和生物學(xué)方法。物理處理主要采用高溫膨化，盡管去除效果較好，但能源消耗較大，成本較高;化學(xué)處理主要采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑處理豆粕，也有一定效果，但容易導(dǎo)致化學(xué)物質(zhì)殘留，且工藝比較復(fù)雜，易污染環(huán)境，其中的氨基酸、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)成分易被破壞，導(dǎo)致豆粕營養(yǎng)價值降低;生物學(xué)處理方法主要采用生物育種和各種生物學(xué)技術(shù)處理豆粕，目前在國內(nèi)外研究較多［4－8］。

微生物發(fā)酵豆粕作為生物學(xué)處理方法之一，已被證明是一種有效的降低和去除抗?fàn)I養(yǎng)因子的方法［9－10］。在豆粕發(fā)酵過程中，微生物不僅能產(chǎn)生多種具有生物學(xué)活性的酶類，有效鈍化其中的胰蛋白酶抑制劑等抗?fàn)I養(yǎng)因子，而且豆粕中的蛋白質(zhì)還可以被微生物產(chǎn)生的蛋白酶分解為小肽，易于被動物消化吸收，從而提高了利用率和營養(yǎng)價值，改善了適口性。目前，用于豆粕發(fā)酵的微生物菌種主要有酵母菌、芽孢桿菌、米曲霉、乳酸菌等，有的采用單菌發(fā)酵，有的采用多菌種混合發(fā)酵。由于影響豆粕發(fā)酵的因素很多，而國內(nèi)有關(guān)豆粕發(fā)酵的適宜菌種選擇及發(fā)酵工藝參數(shù)的研究剛剛起步，尤其是在菌種選擇、發(fā)酵的工藝參數(shù)及對豆粕營養(yǎng)價值影響的研究結(jié)果差異較大［11－13］。為了進(jìn)一步了解微生物發(fā)酵對豆粕品質(zhì)的影響，本文采用枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌作為發(fā)酵菌株，主要以豆粕中最主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子—胰蛋白酶抑制劑為指標(biāo)，研究了接種量、料水比、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等對發(fā)酵豆粕的影響，旨在確定豆粕適宜的發(fā)酵參數(shù)以及發(fā)酵對豆粕品質(zhì)的影響，為生產(chǎn)實踐中豆粕的發(fā)酵及應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和豆粕

枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室保存。豆粕為市售，國產(chǎn)，含水量12.5%，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)42.85%。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超凈工作臺:蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司;SPH－200D型恒溫?fù)u床:上海世平實驗設(shè)備有限公司;LHS－250SC型恒溫培養(yǎng)箱:北京中科浩宇科技發(fā)展有限公司;YAMATO sp300型高壓滅菌鍋:日本大和科學(xué)株式會社;DU－800型紫外－可見分光光度計:美國Beckman公司;AR2140型電子分析天平:美國Ohaus公司;DD－5型離心機(jī):長沙湘麓離心機(jī)儀器有限公司;pHS－3C型數(shù)字酸度計:成都世紀(jì)方舟科技有限公司;UDK142型全自動凱氏定氮儀:意大利VELP公司;835－50型氨基酸分析儀:日本日立公司。

1.1.3 種子培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基采用牛肉膏培養(yǎng)基(牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉 5.0 g，瓊脂 15.0 g，葡萄糖15.0 g，蒸餾水1 000 mL);酵母菌培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(馬鈴薯20.0 g，葡萄糖2.0 g，瓊脂2.0 g，蒸餾水 100 mL，自然 pH);乳酸菌培養(yǎng)基為MRS 培養(yǎng)基(蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 10.0 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖 20.0 g，檸檬酸氫二銨 2.0 g，吐溫 －80 1.0 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL)

1.2 發(fā)酵方法

1.2.1 種子培養(yǎng)方法

菌種活化后接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后測定菌體密度。

1.2.2 發(fā)酵豆粕的生產(chǎn)工藝

豆粕→預(yù)處理(粉碎，過40目篩)→加水，配制發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基→滅菌→接種→發(fā)酵→干燥→粉碎。其中，接種的枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌均為在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后的培養(yǎng)液。

1.2.3 不同條件對發(fā)酵的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基上，研究不同發(fā)酵條件對豆粕發(fā)酵的影響。

1.2.3.1 接種量對豆粕發(fā)酵的影響。采用枯草桿菌、酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵，通過正交試驗篩選3種菌株的適宜接種量。根據(jù)馬文強(qiáng)等［8］和姚曉紅等［14］研究資料確定接種量。試驗因素和水平見表1。度分別設(shè)定為20、25、30、35、40℃。根據(jù)適宜的接種量和料水比，測定發(fā)酵72 h后的胰蛋白酶抑制劑含量［14］，確定適宜的發(fā)酵溫度。

1.2.3.4 發(fā)酵時間對豆粕發(fā)酵的影響。發(fā)酵時間設(shè)定為 24、48、60、72、84、96 h。根據(jù)適宜的接種量、料水比和發(fā)酵起始溫度，確定適宜的發(fā)酵時間。

1.2.3.5 初始pH對豆粕發(fā)酵的影響。用緩沖液將培養(yǎng)基的初始 pH 分別調(diào)為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0及pH自然(自來水)，72 h后測定豆粕中胰蛋白酶抑制劑的含量。

1.2.4 綜合發(fā)酵試驗

根據(jù)上述發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果，進(jìn)行綜合發(fā)酵試驗，通過測定豆粕胰蛋白酶抑制劑活性及營養(yǎng)成分含量，驗證發(fā)酵對豆粕品質(zhì)的影響。

1.3 豆粕成分分析測定

1.3.1 胰蛋白酶抑制劑活性測定

采用改進(jìn)的PAPNA法［15］。準(zhǔn)確稱取3 g豆粕樣品于三角瓶中，加入50 mL Tris緩沖液，振蕩3 h后，2 700 r/min離心10 min，取上清液按20～30倍稀釋。取上述稀釋好的樣品液1 mL于試管中，加入2.5 mL BAPNA溶液，將試管置于37℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，加入1 mL牛胰蛋白酶溶液，準(zhǔn)確計時，反應(yīng)10 min后加入0.5 mL 30%醋酸終止反應(yīng)。410 nm比色。按同樣方法同時測定空白溶液，只是先加入30%醋酸然后加入牛胰蛋白酶溶液。每個樣品設(shè)3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。

式中:TIA為胰蛋白酶抑制因子活性/mg/g;A1為樣品溶液410 nm的吸光值;A2為空白溶液410 nm的吸光值;W為樣品質(zhì)量/g;0.019為1μg牛胰蛋白酶410 nm吸光值;D為稀釋倍數(shù)。

1.3.2 常規(guī)營養(yǎng)成分的測定

粗蛋白質(zhì)含量的測定采用凱氏定氮法GB/T 6432—1994;粗脂肪測定采用索氏抽提法 GB/T 6433—1994;氨基酸態(tài)氮含量的測定參考陳美春等的方法，采用雙指示劑甲醛滴定法［16］。所有測定樣品均設(shè)3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.3.3 氨基酸含量的測定

豆粕中氨基酸含量的測定參考《飼料中氨基酸的測定，GB/T 18246—2000》，采用氨基酸自動分析儀測定。其中，含硫氨基酸的測定采用氧化酸解法，色氨酸的測定采用堿解法［17］。所有測定樣品均設(shè)3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。

表1 菌株接種量正交試驗設(shè)計

1.2.3.2 料水比對豆粕發(fā)酵的影響。不考慮豆粕本身的含水量，料水比設(shè)定為 1∶0.5、1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8、1∶0.9、1∶1.0、1∶1.1、1∶1.2。根據(jù)篩選的適宜接種量，測定發(fā)酵初始溫度為30℃，發(fā)酵72 h后豆粕中胰蛋白酶抑制劑含量［14］，確定適宜的料水比。

1.2.3.3 溫度對豆粕發(fā)酵的影響。發(fā)酵初期的溫

2 結(jié)果與討論

2.1 接種量對發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制劑含量的影響

接種量直接影響發(fā)酵效果，適宜的接種量是保證發(fā)酵豆粕品質(zhì)的基礎(chǔ)。本試驗研究結(jié)果(表2)表明，3種菌株發(fā)酵豆粕，對胰蛋白酶抑制劑的滅活效果，按影響力大小的次序為枯草芽孢桿菌﹥酵母菌﹥?nèi)樗峋?，最佳接種量為枯草芽孢桿菌4%，酵母菌5%，乳酸菌2%。該結(jié)果與付弘赟等［18］和姚曉飛等［19］的研究結(jié)果一致，證明枯草芽孢桿菌、酵母菌等可通過產(chǎn)生各種蛋白酶而鈍化其中的胰蛋白酶抑制劑，同時，枯草芽孢桿菌的鈍化效果最好。

表2 接種量對發(fā)酵豆粕胰蛋白酶抑制劑(TI)含量的影響

2.2 料水比對發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制劑含量的影響

基質(zhì)含水量不僅影響微生物的生長，還影響發(fā)酵系統(tǒng)中氧氣的供應(yīng)、氣體交換等活動，關(guān)系到發(fā)酵的成敗［20］。不同含水量對發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制劑含量的影響結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，當(dāng)豆粕與水的比例在1∶0.9～1∶1.2 時，豆粕中胰蛋白酶抑制劑的含量最低，發(fā)酵效果較好。根據(jù)試驗結(jié)果，并考慮到后期烘干成本，可選擇1∶0.9作為發(fā)酵適宜的料水比。

圖1 料水比對發(fā)酵豆粕胰蛋白酶抑制劑含量的影響

2.3 起始溫度對發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制劑含量的影響

溫度直接影響微生物的生長，發(fā)酵的起始溫度過低或過高均不利于微生物的生長繁殖，從而影響發(fā)酵效果。由圖2可見，3種菌株發(fā)酵的起始溫度在30℃時，豆粕中胰蛋白酶抑制劑的含量最低，因而適宜的發(fā)酵起始溫度為30℃。

圖2 發(fā)酵起始溫度對豆粕中胰蛋白酶抑制劑含量的影響

2.4 發(fā)酵時間對豆粕中胰蛋白酶抑制劑含量的影響

發(fā)酵時間對豆粕中胰蛋白酶抑制劑含量的影響見圖3?？梢姡S著發(fā)酵時間的延長，豆粕中胰蛋白酶抑制劑的含量顯著降低，發(fā)酵時間72 h、84 h和96 h豆粕中胰蛋白酶抑制劑的含量最低。綜合考慮生產(chǎn)效率和發(fā)酵成本，本試驗的適宜發(fā)酵時間為72 h。

圖3 不同發(fā)酵時間對豆粕這胰蛋白酶抑制劑含量的影響

2.5 初始pH對發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制劑含量的影響

初始pH對發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制劑含量的影響見圖4?？梢钥闯?，當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH為7.0或者pH為自然(自來水)時，豆粕中胰蛋白酶抑制劑的含量最低，培養(yǎng)基的pH過高或過低都會影響微生物的正常發(fā)酵，導(dǎo)致豆粕中胰蛋白酶抑制劑的含量偏高。因此，培養(yǎng)基適宜的初始pH為7.0或者pH為自然(自來水)?？紤]到操作的簡便性，實際發(fā)酵時培養(yǎng)基的初始pH為自然(自來水)時比較適宜。

圖4 初始pH對豆粕胰蛋白酶抑制劑抑制劑含量的影響

2.6 混合發(fā)酵對豆粕組成成分的影響

適宜發(fā)酵條件下，豆粕發(fā)酵前后抗?fàn)I養(yǎng)因子和營養(yǎng)成分含量的變化見表3，氨基酸含量見表4。結(jié)果表明，發(fā)酵豆粕的粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量顯著提高，粗蛋白質(zhì)含量比發(fā)酵前提高12.12%，粗脂肪含量提高11.68%，這與馬文強(qiáng)等［8］的研究比較一致，可能是發(fā)酵過程中，豆粕中的碳源被發(fā)酵損耗致養(yǎng)分間的相對比例發(fā)生變化，同時豆粕中的胰蛋白酶抑制劑等抗?fàn)I養(yǎng)因子被微生物降解去除，使粗蛋白質(zhì)含量相對增加。氨基酸態(tài)氮是衡量發(fā)酵產(chǎn)品發(fā)酵程度的重要指標(biāo)，發(fā)酵豆粕的氨基酸態(tài)氮含量是發(fā)酵前的10.87倍，說明發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生的蛋白酶將蛋白質(zhì)水解為氨基酸、小分子肽類，導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮含量大量增加。此外，在適宜條件下發(fā)酵的豆粕，胰蛋白酶抑制劑得到了有效去除，改善了豆粕的整體品質(zhì)。

由表4可見，發(fā)酵前后豆粕氨基酸含量發(fā)生了顯著變化，無論是必需氨基酸還是非必需氨基酸含量，發(fā)酵豆粕都明顯高于非發(fā)酵豆粕。8種必需氨基酸總量發(fā)酵后比發(fā)酵前提高12.69%，其中對于畜禽比較重要的賴氨酸和蛋氨酸的含量，發(fā)酵后比發(fā)酵前分別提高12.31%和23.81%，而10種非必需氨基酸的總量發(fā)酵后比發(fā)酵前提高6.81%。這也與蔡國林等［21］和魏炳棟等［22］的研究結(jié)果一致。這可能是由于發(fā)酵過程中，微生物分泌的蛋白酶將豆粕的蛋白質(zhì)分解成大量的游離氨基酸、肽和氨，加之微生物自身分泌的一些酶類，致使發(fā)酵產(chǎn)物中各種氨基酸含量顯著增加。同時由于氨基酸含量的增加，也在一定程度上改善了發(fā)酵豆粕的適口性。

3 結(jié)論

3.1 綜合以上試驗結(jié)果，本試驗條件下，采用多種菌株發(fā)酵豆粕，理想的發(fā)酵條件為:接種量枯草芽孢桿菌4%、酵母菌5%、乳酸菌2%，料水比1∶0.9，發(fā)酵的起始溫度為30℃，發(fā)酵時間為72 h，培養(yǎng)基的初始pH為自然(自來水)。

3.2 豆粕發(fā)酵后可有效去除胰蛋白酶抑制劑。

3.3 豆粕發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量提高12.12%，而氨基酸態(tài)氮含量發(fā)酵后是發(fā)酵前的10.87倍。發(fā)酵豆粕中必需氨基酸和非必需氨基酸含量均顯著提高，改善了豆粕品質(zhì)。

表3 豆粕發(fā)酵前后各種成分的比較

表4 豆粕發(fā)酵前后氨基酸含量的變化(干物質(zhì)基礎(chǔ))

［1］王春林，陳喜斌，于炎湖，等.大豆中抗?fàn)I養(yǎng)因子及其處理方法［J］.飼料工業(yè)，2000，21(9):12 －14

［2］Huisman J.Antinutritional effects of legume seeds in piglets，rats and chickens［D］.Waveningen State:Waveningen University，1990

［3］Barth C A，Lurnling B，Schmitz M，et al.Soybean trypsin inhibitors reduce absorption of exogenous and increase loss of endogenous protein in immature pigs［J］.Journal of Nutrition，1993，123(12):2195 －2200

［4］Sessa D J，Haney J K，Nelsen T C.Inactivation of soybean trypsin inhibitors with ascorbic acid plus copper［J］.Journal of agricultural and food chemistry，1990，38(7):1469 －1474

［5］Anderson R L.Effects of steaming on soybean proteins and trypsin inhibitors［J］.Journal ofthe American Oil Chemists'Society，1992，69(12):1170 －1176

［6］肖玲，龔月生.熱處理對豆粕品質(zhì)的影響［J］.糧食與飼料工業(yè)，2000(4):23－25

［7］曹鈺，蔡國林，陸健.提高豆粕營養(yǎng)價值的研究進(jìn)展［J］.飼料與畜牧，2007(6):13－15

［8］馬文強(qiáng)，馮杰，劉欣.微生物發(fā)酵豆粕營養(yǎng)特性研究［J］.中國糧油學(xué)報，2008，23(1):121 －124

［9］李樹宏，鄺哲師，楊金波，等.發(fā)酵豆粕概述［J］.飼料博覽，2007(23):12－15

［10］Hong K J，Lee C H，Kim S W.Aspergillus oryae GB －107 fermentation improves nutritional quality of food soybean and feed soybean meals［J］.Journal of Medical Food，2004，7(4):430－436

［11］朱曦，田慧云.混合發(fā)酵去除豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子最佳發(fā)酵條件的研究［J］.養(yǎng)殖與飼料，2007(1):44－46

［12］惠明，孟可，田青，等.復(fù)合菌株固態(tài)發(fā)酵豆粕的研究［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2009，30(4):61－64

［13］吳勝華，李呂木，張邦輝，等.酵母菌單菌固態(tài)發(fā)酵豆粕的研究［J］.中國糧油學(xué)報，2009，24(7):41 －44

［14］姚曉紅，吳逸飛，湯江武，等.微生物混合發(fā)酵去除豆粕中胰蛋白酶抑制劑的研究［J］.中國飼料，2005，(24):16－18

［15］李素芬，霍貴成，楊麗潔，等.黑龍江省主要大豆品種中胰蛋白酶抑制因子含量研究［J］.中國飼料，2001(5):8－11

［16］陳美春，康明武，楊勇.醬油中氨基酸態(tài)氮測定方法的探討［J］.四川食品與發(fā)酵，2008，44(2):54－56

［17］張麗英.飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)［M］.第3版.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2007

［18］付弘贇，李呂木，蔡?，?，等.菌種和發(fā)酵條件對發(fā)酵豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響［J］.畜牧與獸醫(yī)，2009，41(6):32－35

［19］姚曉飛，葉璐，趙世敏.枯草芽孢桿菌的選育及其發(fā)酵豆粕的工藝條件研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(16):8476－8478

［20］Kanekar P，Joshi N，Sarnaik S，et al.Effect of fermentation by lactic acid bacteria from soybean seeds on trypsin inhibitor(TI)activity［J］.Food Microbiology，1992，9(3):245 －249

［21］蔡國林，楊旭，曹鈺，等.微生物發(fā)酵對豆粕營養(yǎng)價值的影響［J］.中國油脂，2008，33(10):21 －24

［22］魏炳棟，陳群，劉海燕，等.乳酸菌固態(tài)發(fā)酵對豆粕蛋白質(zhì)含量、體外消化率及游離氨基酸含量的影響［J］.飼料博覽，2010(3):3－5.