穰 真，崔 凡，李 薇，王有為

(1.四川大學華西醫(yī)院皮膚性病科，四川 成都 610041;2.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所，四川 成都 610031)

目前已知的11種馬拉色菌中，除厚皮馬拉色菌外，都屬于嗜脂性酵母[1]。Benham于1939年首次發(fā)現(xiàn)馬拉色菌的生長依賴于培養(yǎng)基中含有的脂類物質(zhì)[2]。由此，一系列的馬拉色菌培養(yǎng)基應(yīng)運而生，使得馬拉色菌的培養(yǎng)和鑒定不再困難。在此基礎(chǔ)上關(guān)于馬拉色菌的致病機制和分型方面的研究得以順利開展。目前比較常用的馬拉色菌培養(yǎng)基有兩種，分別為 Leeming＆Notman 培養(yǎng)基[3]和 Dixon 培養(yǎng)基[4]。由于馬拉色菌胞壁富含脂類而韌性高，為破壁提取DNA增加了難度。因此，為了保證所提取DNA的數(shù)量和質(zhì)量，實驗所用菌量非常重要。目前馬拉色菌在傳統(tǒng)Leeming＆Notman培養(yǎng)基以及Dixon培養(yǎng)基上的生長條件為35℃，7天。本研究利用馬拉色菌對于脂質(zhì)的依賴性，通過改變Leeming＆Notman培養(yǎng)基中橄欖油和吐溫60的含量，摸索出能顯著提高馬拉色菌培養(yǎng)菌產(chǎn)量的方案，并驗證。

1 材料與方法

1.1 馬拉色菌培養(yǎng) 傳統(tǒng)的Leeming＆Notman培養(yǎng)基配方為：1%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.1%酵母浸膏、0.4%牛膽鹽、0.1%甘油、0.05%單硬脂酸甘油酯、0.05%吐溫60、1%全脂奶、2%橄欖油、1.2%瓊脂、0.5%放線菌酮、0.05%氯霉素。本研究共設(shè)3組，每組設(shè) 3個樣本：第 1組含 1%橄欖油和0.025%吐溫60，其余成分含量不變;第2組含2%橄欖油和0.05%吐溫60，即標準的Leeming＆Notman培養(yǎng)基;第3組含4%橄欖油和0.1%吐溫60。制備上述3種培養(yǎng)基各10ml，倒入小平皿內(nèi)。取一環(huán)球形馬拉色菌在1ml滅菌蒸餾水中研磨均勻，用移液器各取5μl含菌懸液滴加入培養(yǎng)基中央，置恒溫箱35℃保存。自培養(yǎng)第3、5、7天，每天測量菌落直徑并拍照。

1.2 馬拉色菌DNA提取及含量分析 在培養(yǎng)第7天，刮取各菌落，用CTAB法提取馬拉色菌基因組DNA[5]。將DNA 溶解于50μl純凈水，吸取 10 μl DNA溶液，轉(zhuǎn)移至990μl純凈水，于分光光度計下讀取260nm波段的OD值。DNA濃度(mg/m l)=50×(260 nm的OD值)×稀釋倍數(shù)(本實驗為100)。

1.3 擴增馬拉色菌ITS1-2區(qū) 參照文獻[6]設(shè)計真菌ITS1和ITS2引物(由上海生物工程有限公司合成)，擴增馬拉色菌基因組ITS1-2區(qū)。反應(yīng)體系為 DNA 1 μl、10×buffer 5 μl、Mgcl2(25 mmol/L)3 μl、dNTP(10 mmol/L)1 μl、引物(10μmol/L)各 1 μl、Taq DNA 聚合酶(BBI)2.5 U，用去離子水補足至50μl。反應(yīng)條件：94℃預變性5 min，94℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，連續(xù)35 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。得到的PCR產(chǎn)物于120 V泳動20分鐘，經(jīng)EB染色后凝膠呈像。

1.4 統(tǒng)計學方法 所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，使用SPSS 11.0軟件進行組間差異性比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

培養(yǎng)第3日，4%橄欖油組馬拉色菌在Leeming＆Notman培養(yǎng)基上的生長速度和2%橄欖油組差異無統(tǒng)計學意義[(5.83±0.76)mm vs(4.83±0.29)mm，P=0.101]，但在后者的生長速度明顯超過1%橄欖油組[(4.83±0.29)mm vs(2.67±0.58)mm，P=0.004]。培養(yǎng)第5日，4%橄欖油組的生長速度顯著快于2%橄欖油組[(7.33±0.29)mm vs(6.17±0.29)mm，P=0.008]。隨著培養(yǎng)時間的延長，各組之間的差異進一步擴大。第7日，4%橄欖油組的馬拉色菌無論是生長速度還是菌落直徑都高于另兩組(圖1)，證明橄欖油含量的增加對馬拉色菌的生長有顯著促進作用。在培養(yǎng)第7天，生長于含4%橄欖油Leeming＆Notman培養(yǎng)基的馬拉色菌DNA濃度顯著高于2%橄欖油組[(273.33±24.66)mg/ml vs(205.67±13.32)mg/ml，P=0.014]，而后者亦高于1%橄欖油組[(205.67±13.32)mg/ml vs(118.33±15)mg/ml，P=0.002]，見圖 2。該結(jié)果提示改良的Leeming＆Notman培養(yǎng)基增加培養(yǎng)菌量，從而直接提高DNA的產(chǎn)出。擴增不同組馬拉色菌DNA的ITS1-2區(qū)，電泳后可見長度約280 bp片段，同時4%橄欖油組PCR產(chǎn)物的熒光強度明顯高于2%橄欖油組和1%橄欖油組(圖3)。該結(jié)果提示由于含4%橄欖油的培養(yǎng)基增加了馬拉色菌DNA產(chǎn)量，其PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量也得到相應(yīng)提高。

圖1 球形馬拉色菌在含不同濃度橄欖油的Leeming＆Notman培養(yǎng)基上的生長狀況 a：培養(yǎng)第3、5、7日的菌落形態(tài);b：培養(yǎng)第3、5、7日的菌落直徑

圖2 球形馬拉色菌在含不同濃度橄欖油的Leeming＆Notman培養(yǎng)基上的DNA產(chǎn)量

圖3 球形馬拉色菌ITS1-2區(qū)電泳結(jié)果1：DNA marker;2：陰性對照;3：1%橄欖油組;4：2%橄欖油組;5：4%橄欖油組

3 討論

馬拉色菌是一種嗜脂性的真菌，其生長速度與所處環(huán)境的含脂量成正比。這一點也在與馬拉色菌相關(guān)的疾病中得到證實。馬拉色菌所引起的疾病通常好發(fā)于皮脂豐富的區(qū)域，因為這些區(qū)域為馬拉色菌的生長提供了必需的脂源[7]。

本研究針對Leeming＆Notman培養(yǎng)基的橄欖油含量設(shè)立了3組含有不同脂質(zhì)比例的培養(yǎng)基，動態(tài)觀察了菌落的生長狀況。實驗結(jié)果表明4%橄欖油對馬拉色菌生長的促進作用是顯而易見的。無論是馬拉色菌的生長速度還是最終菌落直徑都較標準的含2%橄欖油的Leeming＆Notman培養(yǎng)基組和1%橄欖油組高。DNA定量檢測證實在相同培養(yǎng)時間內(nèi)，獲得菌量越大，提取的基因組DNA也越多。當前的醫(yī)學真菌學研究更多地使用各種分子生物學技術(shù)對真菌的功能性基因及其編碼的生物活性蛋白進行分析。真菌種屬的分型鑒定研究也離不開相應(yīng)的分子生物學技術(shù)。因此提供足量、優(yōu)質(zhì)的真菌基因組DNA是這些研究的前提。我們擴增了馬拉色菌ITS1-2區(qū)，進一步證實更多的DNA產(chǎn)出保證了PCR產(chǎn)物的質(zhì)量。改良的含4%橄欖油的Leeming＆Notman培養(yǎng)基有利于提高馬拉色菌科研工作的效率。

本研究的創(chuàng)新之處在于通過將Leeming＆Notman培養(yǎng)基中橄欖油含量增加到4%，加速了馬拉色菌的生長速度，縮短了培養(yǎng)周期。我們在增加橄欖油含量的同時，也相應(yīng)增加吐溫60的含量。吐溫60是一種乳化劑。增加吐溫60的目的是使得培養(yǎng)基中的油相和水相更好的交融，避免出現(xiàn)油含量增多導致的油水分層。而吐溫60對球形馬拉色菌的生長沒有促進作用[8]，所以可以確定馬拉色菌的快速生長完全是橄欖油作用的結(jié)果。我們也嘗試進一步增加橄欖油含量，結(jié)果會出現(xiàn)培養(yǎng)基的油相和水相分層，而且馬拉色菌生長增快不明顯，最重要的是過多的油介入會影響DNA的提取質(zhì)量。所以經(jīng)改良含4%橄欖油和0.1%吐溫60的Leeming＆Notman培養(yǎng)基是保證馬拉色菌生長數(shù)量和質(zhì)量的最佳平衡點。

[1]Midgley G.The lipophilic yeasts:state of the art and prospects[J].Med Mycol，2000，38(Suppl 1):9-16.

[2]Benham RW.The cultural characteristics of Pityrosporum ovale-alipophilic fungus[J].J Investig Dermatol，1939，2:187-203.

[3]van Belkum A，Boekhout T，Bosboom R.Monitoring spread of Malassezia infections in a neonatal intensive care unit by PCR-mediated genetic typing[J].JClin Microbiol，1994，32:2528-2532.

[4]Guillot J，Gueho E，Lesourd M.Identification of Malassezia species:a practical approach[J].JMycol Med，1996，6:103-110.

[5]崔凡，陶詩沁，沈永年，等.馬拉色菌臨床株分類鑒定的研究[J].中華皮膚科雜志，2005，38(8):492-494.

[6]Aizawa T，Kano R，Nakamura Y，etal.Molecular heterogeneity in clinical isolates ofMalassezia pachydermatis from dogs[J].Veterinary Microbiology，1999，70(1-2):67-75.

[7]Roberts SOB.Pityrosporum orbiculare:incidence and distribution on clinically normal skin[J].Br JDermatol，1969，81:264-269.

[8]Nakabayashi A，Sei Y，Guillot J.Identification of Malassezia species isolated from patientswith seborrhoeic dermatitis，atopic dermatitiss，pityriasis versicolor and normal subjects[J].Medical Mycology，2000，38:337-341.