孵化期注射維生素C對(duì)肉雞生產(chǎn)性能、免疫和抗氧化性能的影響

李世召 支麗慧 楊小軍 姚軍虎

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊陵 712100)

免疫力缺乏和大量應(yīng)激的存在是肉雞規(guī)模化養(yǎng)殖的兩大挑戰(zhàn)。免疫力缺乏可使肉雞容易感染各種疾病，造成大量死亡;還會(huì)將更多能量用于維持免疫，影響生產(chǎn)性能。應(yīng)激情況下，肉雞體內(nèi)產(chǎn)生的多余氧自由基會(huì)和細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，破壞核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展［1］。因此，引進(jìn)、推廣優(yōu)良肉雞品種，并通過(guò)最恰當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行營(yíng)養(yǎng)調(diào)控來(lái)提高肉雞的免疫和抗氧化能力顯得尤為重要。維生素C是一種水溶性維生素，具有抗應(yīng)激［2］、抗氧化［3］和提高免疫力［4］等功能，但易氧化的特性使其在飼糧和飲水中直接添加受到限制［5］。而長(zhǎng)久以來(lái)，為了使家禽獲得更好的生產(chǎn)性能，研究者也多采用改善飼養(yǎng)或繁殖環(huán)境、優(yōu)化營(yíng)養(yǎng)配比的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)［6］。近年來(lái)種蛋顯微操作技術(shù)的發(fā)展為家禽營(yíng)養(yǎng)調(diào)控開(kāi)辟了一個(gè)全新的領(lǐng)域——胚蛋注射營(yíng)養(yǎng)(in ovo feeding，IOF)［6-7］。IOF 源于雞胚接種技術(shù)，是指將外源營(yíng)養(yǎng)素注射到家禽的胚蛋中［8］。研究表明，IOF 能促進(jìn)家禽的胚胎發(fā)育［9］、能量?jī)?chǔ)備［10］和出雛后的生長(zhǎng)發(fā)育［11］等。薩索(Sasso)肉雞是由法國(guó)SASSO公司專門(mén)選育的有色優(yōu)質(zhì)肉雞，具有肉質(zhì)好、生長(zhǎng)快和抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在歐洲市場(chǎng)廣受歡迎［12］。于Sasso肉雞種蛋孵化的合適時(shí)期外源注射維生素C可能會(huì)改善其生產(chǎn)性能、免疫和抗氧化性能。因此，本試驗(yàn)旨在探索通過(guò)IOF方式補(bǔ)充維生素C來(lái)提高肉雞生產(chǎn)性能、免疫和抗氧化性能的可行性，以期為后續(xù)研究提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

孵化機(jī):藍(lán)電孵化機(jī)(9TV-3A，北京藍(lán)天蛟電子技術(shù)有限公司)。

維生素 C 標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma，A5960):C6H8O8，純度≥99.0%。

種蛋:Sasso肉雞(C44，淺紅羽)種蛋180枚，購(gòu)于西安市高陵祖代雞場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。將180枚Sasso肉雞種蛋隨機(jī)分為3個(gè)處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15枚。于種蛋孵化第11天進(jìn)行注射:對(duì)照組每枚種蛋注射0.1 mL生理鹽水，維生素C注射組每枚種蛋分別注射含3和15 mg維生素C的0.1 mL的生理鹽水。孵化21 d出雛后，每重復(fù)選取體重均勻、健康的雛雞10只進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期42 d。

1.3 孵化與飼養(yǎng)管理

1.3.1 孵化管理

溫度:前期(1～10 d)控制在38.0～38.2℃，后期(11～18 d)控制在37.8～38.0℃，落盤(pán)(19～21 d)控制在37.5～37.8℃;濕度:45% ～65%;翻蛋:翻蛋周期為 120 min，翻蛋時(shí)間為180 s;孵化前期注意控溫，孵化后期注意通風(fēng)。

1.3.2 種蛋注射

注射體積:0.1 mL;注射部位:卵黃囊;維生素C注射液的配制:將維生素C溶解在生理鹽水中，分別配制成30和150 mg/mL的注射液。

注意事項(xiàng):種蛋孵化第11天進(jìn)行注射，注射前先照蛋，剔除死胚蛋和無(wú)精蛋，同時(shí)確定胚胎在種蛋中的大致位置;注射前用75%酒精在注射點(diǎn)附近擦拭消毒;注射器針頭的長(zhǎng)度和管徑要適宜;1枚種蛋用1枚針頭;注射完用塑膠封口。

1.3.3 飼養(yǎng)管理

參照NRC(1994)肉雞營(yíng)養(yǎng)需要配制基礎(chǔ)飼糧(表1)。試驗(yàn)雞采用3層階梯式籠養(yǎng)，各重復(fù)均勻分布于雞舍，自由采食和飲水。按常規(guī)程序進(jìn)行雞只免疫和欄舍消毒。整個(gè)飼養(yǎng)階段的飼糧和飲水中不以任何形式添加維生素C。

1.4 樣品采集與制備

于肉雞1、21和42日齡時(shí)，每重復(fù)挑選與該重復(fù)平均體重相近的肉雞1只，1日齡頸靜脈采血1 mL(肝素鈉抗凝)，21和42日齡翅靜脈采血10 mL(肝素鈉抗凝)，均3 000 r/min離心10 min，取分離后的血漿分裝于1.5 mL EP管中，-80℃保存，用于生化指標(biāo)的測(cè)定。試驗(yàn)雞采血結(jié)束，頸部放血致死，取脾臟和法氏囊進(jìn)行稱重。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 生產(chǎn)性能的測(cè)定

分別于肉雞21和42日齡(之前停飼12 h)按重復(fù)稱體重和剩料量，計(jì)算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.5.2 免疫指標(biāo)的測(cè)定

1.5.2.1 免疫器官指數(shù)

1.5.2.2 流式細(xì)胞分析

分別于肉雞21和42日齡時(shí)，每重復(fù)隨機(jī)挑選1只雞，翅靜脈采血，肝素鈉抗凝:用微量取樣器沿管壁取1 mL抗凝血于離心管中，迅速加入低溫保存的磷酸鹽緩沖液(PBS)1 mL，慢慢混勻;將混合液沿管壁緩慢加入到盛有2 mL淋巴細(xì)胞分層液(室溫預(yù)置)的試管中，2 000 r/min離心25 min;吸取中間乳白色淋巴細(xì)胞層于預(yù)冷的離心管中，加適量PBS，混勻，4℃ 下2 000 r/min離心15 min;棄上清，加適量PBS，混勻，4℃ 下2 000 r/min離心10 min;加入PBS 500μL，充分混勻，取200μL混懸液依次加入CD3單抗和CD8單抗10μL，及CD4單抗5μL，充分混勻，低溫避光孵育30 min;加PBS于離心管0.5刻度線處，4℃下1 500 r/min離心5 min，加適量PBS上流式細(xì)胞儀測(cè)定。

1.5.3 血漿抗氧化性能的測(cè)定

血漿總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定:Fe3+還原法;谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性測(cè)定:二硫代二硝基苯甲酸比色法;超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定:黃嘌呤氧化酶法;丙二醛(MDA)含量測(cè)定:硫代巴比妥酸(TBA)比色法;試劑盒均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行one-way ANO-VA，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05為 顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(as-fed basis) %

2 結(jié)果與分析

2.1 孵化期注射維生素C對(duì)種蛋孵化率和肉雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，3 mg注射組的種蛋孵化率和肉雞初生重顯著高于其他組(P＜0.05)，生理鹽水注射組和15 mg注射組的種蛋孵化率和肉雞初生重均差異不顯著(P＞0.05)。

孵化期注射維生素C對(duì)1～21日齡肉雞的ADFI無(wú)顯著影響(P＞0.05)，但3 mg注射組22～42日齡和1～42日齡肉雞的ADFI顯著提高(P＜0.05)。各組22～42日齡和1～42日齡肉雞的ADG均差異不顯著(P＞0.05)，但3 mg注射組1～21日齡肉雞的ADG顯著低于生理鹽水注射組(P＜0.05)。與生理鹽水注射組相比，3 mg注射組1～21日齡肉雞的F/G顯著提高(P＜0.05)，且3 mg注射組1～42日齡肉雞的F/G顯著高于其他組(P＜0.05)。

表2 孵化期第11天注射維生素C對(duì)種蛋孵化率和肉雞生產(chǎn)性能的影響Table 2 Effects of vitamin C injection at 11 days of incubation period on hatchability and performance of broilers

2.2 孵化期注射維生素C對(duì)肉雞免疫性能的影響

由表3可知，與生理鹽水注射組相比，孵化期注射3和15 mg維生素C使肉雞脾臟指數(shù)在21日齡分別降低了19.0%和18.4%，在42日齡分別降低了13.6%和12.6%;法氏囊指數(shù)在21日齡分別降低了31.2%和30.9%，在42日齡分別降低了27.6%和26.2%，但方差分析均差異不顯著(P＞0.05)。

表3 孵化期第11天注射維生素C對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響Table 3 Effects of vitamin C injection at 11 days of incubation period on immune organ indexes of broilers %

由表4可知，各組肉雞21和42日齡外周血CD3+CD4+比例、CD3+CD8+比例和 CD3+CD4+/CD3+CD8+均差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 孵化期注射維生素C對(duì)肉雞抗氧化性能的影響

由表5可知，15 mg注射組肉雞21日齡血漿T-AOC顯著高于3 mg注射組(P＜0.05)，42日齡各組血漿T-AOC差異不顯著(P＞0.05)。各組21日齡肉雞血漿GSH-Px和SOD活性差異不顯著(P＞0.05)，但15 mg注射組42日齡肉雞血漿GSH-Px和SOD活性顯著高于生理鹽水注射組和3 mg注射組(P＜0.05)。各組21和42日齡肉雞血漿MDA含量均差異不顯著(P＞0.05)。

表4 孵化期第11天注射維生素C對(duì)肉雞外周血T淋巴細(xì)胞亞型比例的影響Table 4 Effects of vitamin C injection at 11 days of incubation period on lymphocyte subset of peripheral blood T lymphocyte of broilers

表5 孵化期第11天注射維生素C對(duì)肉雞抗氧化性能的影響Table 5 Effects of vitamin C injection at 11 days of incubation period on antioxidant function of broilers

3 討論

3.1 孵化期注射維生素C對(duì)種蛋孵化率和肉雞生產(chǎn)性能的影響

3.1.1 孵化期注射維生素C對(duì)種蛋孵化率的影響

對(duì)于孵化場(chǎng)而言，種蛋孵化率提高意味著經(jīng)濟(jì)效益提高，而種蛋中注射營(yíng)養(yǎng)素可提高孵化率［13-14］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，種蛋中注射3 mg維生素C時(shí)可顯著提高孵化率(P＜0.05)。Elíbol等［15］的研究同樣表明，種蛋孵化第13天注射3 mg的維生素C能顯著降低孵化后期的胚胎死亡率(P＜0.05)。新生卵中不存在維生素C，當(dāng)胚胎發(fā)育至第3～4天時(shí)，可內(nèi)源性合成，但在人工孵化條件下，合成的數(shù)量不能滿足發(fā)育需求［6］。尤其到孵化后期，過(guò)量代謝熱的產(chǎn)生會(huì)影響胚胎發(fā)育［16］，此時(shí)添加維生素 C可有效緩解這種壓力［17］。這是因?yàn)榫S生素C可調(diào)節(jié)腎上腺激素對(duì)21-羥化酶和β-羥化酶的抑制作用，利于腎上腺酮產(chǎn)生，促進(jìn)糖異生，使胚胎有足夠的能量來(lái)適應(yīng)胚胎發(fā)育后期孵化環(huán)境的改變［16］。數(shù)據(jù)表明，白萊航雞種蛋孵化至第15天時(shí)，血漿中維生素C的含量開(kāi)始顯著降低(P＜0.05)［18］，而當(dāng)胚胎發(fā)育到第10天以后，因代謝熱增加可提高胚胎死亡率［16］。但維生素C濃度并非越高越好，若血液中腎上腺酮的含量長(zhǎng)時(shí)間維持在較高水平，會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性，損害機(jī)體健康而降低孵化率［16］。增加維生素C的濃度會(huì)伴隨著對(duì)胰島β細(xì)胞毒性的增加［19］;種蛋孵化前注射750 mg/mL的維生素C對(duì)胚胎是有毒性的［20］。因此本研究中，當(dāng)維生素C的注射量為15 mg時(shí)并未顯著提高種蛋的孵化率(P＞0.05)，可能與高濃度維生素C對(duì)胚胎發(fā)育的毒性有關(guān)。

3.1.2 孵化期注射維生素C對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

與種蛋孵化率的結(jié)果相似，當(dāng)維生素C的注射劑量為3 mg時(shí)，肉雞的初生重顯著高于其他組(P＜0.05)，這可能是因?yàn)榫S生素C在緩解胚胎發(fā)育后期熱應(yīng)激的同時(shí)，促進(jìn)了胚胎發(fā)育。增加維生素C注射劑量并未得到更加積極的作用，則系因高劑量維生素C對(duì)胚胎細(xì)胞存在一定的毒副作用［16，19］。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，孵化期注射3 mg維生素C可一定程度上提高Sasso肉雞生長(zhǎng)后期(22～42日齡)的ADG和ADFI，但同時(shí)提高了F/G。這除了因孵化期注射3 mg維生素C促進(jìn)了胚胎發(fā)育，提高了肉雞初生重外，還可能與本試驗(yàn)所選取的肉雞品種有關(guān)。

3.2 孵化期注射維生素C對(duì)肉雞免疫性能的影響

3.2.1 孵化期注射維生素C對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響

免疫器官稱重法是研究機(jī)體免疫體況的方法之一。一般認(rèn)為免疫器官相對(duì)重量降低為免疫抑制所致，而免疫器官相對(duì)重量增加則為免疫增強(qiáng)的表現(xiàn)［21］。法氏囊和脾臟是家禽重要的免疫器官，其中法氏囊屬于中樞免疫器官，是血清抗體生成系統(tǒng)的細(xì)胞成長(zhǎng)和分化部分，對(duì)雛雞的免疫能力有較大的決定作用;脾臟屬于外周免疫器官，能產(chǎn)生淋巴細(xì)胞和B細(xì)胞，分泌特殊抗體［21］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，孵化期注射3和15 mg維生素C后，21和42日齡的脾臟指數(shù)分別降低了19.0%、18.4%和13.6%、12.6%，法氏囊指數(shù)分別降低了31.2%、30.9%和27.6%、26.2%，但方差分析均差異不顯著(P＞0.05)，說(shuō)明孵化期注射維生素C可能會(huì)抑制肉雞免疫器官發(fā)育。研究表明，雞脾臟在胚胎發(fā)育至12胚齡時(shí)初具輪廓，隨后開(kāi)始快速發(fā)育［22］;對(duì)雞法氏囊功能發(fā)揮有重要作用的黏膜皺襞從孵化期第11～12天開(kāi)始形成［23］。而本試驗(yàn)選取的注射時(shí)間是11胚齡(孵化期第11天)，免疫器官發(fā)育處在關(guān)鍵時(shí)期，可能因注射帶來(lái)的外源刺激而受到影響。另外，孵化期注射維生素C促進(jìn)胚胎在發(fā)育后期利用更多的能量來(lái)緩解熱應(yīng)激，也可能是影響免疫等器官發(fā)育的原因之一。

3.2.2 孵化期注射維生素C對(duì)肉雞外周血T淋巴細(xì)胞亞型的影響

機(jī)體外周血淋巴細(xì)胞的數(shù)量及T淋巴細(xì)胞不同亞型的分布與機(jī)體的免疫狀態(tài)直接相關(guān)［24］。正常情況下，機(jī)體T淋巴細(xì)胞各亞型的數(shù)量和比例相對(duì)穩(wěn)定，它們共同使機(jī)體在遭受外來(lái)抗原刺激時(shí)產(chǎn)生正常的免疫應(yīng)答，維持機(jī)體免疫狀態(tài)平衡［25］。特別是外周血中參與對(duì)外源性抗原識(shí)別的CD4+T淋巴細(xì)胞、內(nèi)源性抗原識(shí)別的CD8+T淋巴細(xì)胞水平及兩者比值(CD4+/CD8+)是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)［24］。

維生素C與免疫系統(tǒng)之間存在明顯交互作用［26］。研究表明，維生素C有助于免疫細(xì)胞免受免疫反應(yīng)時(shí)釋放的酶、酸和氧化物等構(gòu)成的自噬機(jī)制的影響，因此保持細(xì)胞內(nèi)較高的維生素C水平，可使免疫細(xì)胞在遭受病原體侵害時(shí)發(fā)揮更持久的作用［27］。但 McCorkle 等［28］指出細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答不因添加維生素C而受到影響。本試驗(yàn)中，孵化期注射不同水平的維生素C對(duì)肉雞外周血T淋巴細(xì)胞亞型沒(méi)有影響(P＞0.05)，說(shuō)明維生素C不參與T淋巴細(xì)胞亞型分化。McCorkle等［28］同樣認(rèn)為，維生素C可參與 B淋巴細(xì)胞分化，但對(duì)T淋巴細(xì)胞的分化無(wú)調(diào)節(jié)作用。

3.3 孵化期注射維生素C對(duì)肉雞抗氧化性能的影響

肉雞因代謝、生長(zhǎng)發(fā)育快，易發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生對(duì)機(jī)體有害的過(guò)氧化產(chǎn)物［21］。維生素C作為一種抗氧化劑，在細(xì)胞外液中通過(guò)中和機(jī)體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基(O-2·)和羥基自由基(·OH)等自由基及其氧化物，來(lái)保護(hù)生物膜免受脂質(zhì)過(guò)氧化的破壞［29］。

血液和組織的T-AOC、SOD和GSH-Px活性及MDA含量是反映機(jī)體抗氧化性能的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與生理鹽水注射組和3 mg注射組相比，孵化期注射15 mg維生素C可顯著提高肉雞42日齡血漿GSH-Px和SOD活性(P＜0.05)，且15 mg注射組21日齡肉雞血漿T-AOC顯著高于3 mg注射組(P＜0.05)，但與生理鹽水注射組差異不顯著(P＞0.05)。這說(shuō)明孵化期注射15 mg維生素C可在一定程度上提高肉雞的抗氧化性能，這與飼糧中添加維生素C的效果相似。但哪種方式對(duì)抗氧化性能的提高更為突出，需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

①孵化期注射3 mg維生素C可提高肉雞的孵化率、初生重和1～42日齡ADFI，但提高了1～42日齡F/G。

②孵化期注射15 mg維生素C可在一定程度上提高肉雞的抗氧化性能。

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