位瑩瑩 徐奇友 李晉南 王常安 羅 亮 趙志剛

(1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306;2.中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，動物營養(yǎng)實驗室，哈爾濱 150070)

谷氨酰胺是動物體內游離氨基酸池中最為豐富的一種氨基酸，占細胞內游離氨基酸的60%以上［1］。近年來，谷氨酰胺對機體腸道營養(yǎng)與免疫等方面的作用受到了國內外眾多學者的廣泛關注，但是谷氨酰胺單體在溶液中不穩(wěn)定，對溫度和酸堿度敏感，溶解度低，易被環(huán)化為有毒性的焦谷氨酸和氨，上述缺點限制了其在動物生產(chǎn)中的應用。而α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，AKG)作為谷氨酰胺的前體物質，在溶液中具有良好的穩(wěn)定性［2］。AKG在谷氨酸脫氫酶或轉氨酶的作用下生成谷氨酸，并進一步通過谷氨酰胺合成酶形成谷氨酰胺發(fā)揮谷氨酰胺的作用，這種轉變在動物體內是迅速的，從而可以替代谷氨酰胺應用于生產(chǎn)實踐［3］。目前關于 AKG 對仔豬［4-5］、斷奶大鼠［6］等生長、腸道發(fā)育、免疫等方面的影響已有一些文獻報道，而對水產(chǎn)動物的研究仍是一片空白。松浦鏡鯉是黑龍江水產(chǎn)研究所在德國鏡鯉選育系(F4)的基礎上選育的新品種，具有少鱗、生長速度快、體形好、養(yǎng)殖成活率高等優(yōu)點。本試驗擬以松浦鏡鯉為研究對象，研究在不同蛋白質水平飼料中添加AKG對松浦鏡鯉生長性能、體成分和血清生化指標的影響，以期為AKG替代谷氨酰胺應用于水產(chǎn)飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

AKG:購自Sigma-Aldrich公司，白色粉末，純度≥98.5%。

1.2 試驗飼料

根據(jù)鯉魚營養(yǎng)需求配制基礎飼料，以蒸汽魚粉為動物蛋白質源，豆粕為植物蛋白質源，混合油(磷脂∶魚油∶豆油 =1.0∶2.5∶1.5)為脂肪源，以次粉和豆粕的添加比例調節(jié)飼料蛋白質水平。試驗設4個蛋白質水平(28%、31%、34%和37%)，每個蛋白質水平下設3個 AKG濃度［0(對照)、0.75%和1.50%］，共配制12種試驗飼料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。各飼料原料粉碎過80目篩，逐級混合均勻，再加入一定量的水分充分混合后用小型顆粒機擠壓成直徑為2 mm的顆粒飼料，常溫風干后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

1.3 試驗分組及飼養(yǎng)管理

試驗用魚購自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗站，養(yǎng)殖于黑龍江水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖車間的可控溫水循環(huán)系統(tǒng)中，水溫24℃左右，溶氧大于5 mg/L，氨氮小于0.1 mg/L，自然光照。試驗前將松浦鏡鯉經(jīng)3%鹽水消毒后在暫養(yǎng)池馴養(yǎng)2周，挑選體健無傷、規(guī)格整齊、平均體重為(61.28±3.40)g的松浦鏡鯉720尾，隨機分成12組，每組3個重復，每個重復20尾魚。12組試驗魚分別投喂不同的試驗飼料，每天飽食投喂，日投喂3次，分別為每天的08:00、13:00、18:00，同時記錄投喂量，投喂30 min后，收集殘餌，烘干后稱重，定期換水、消毒，確保水質良好。養(yǎng)殖周期為8周。

1.4 樣品采集及指標測定

1.4.1 樣品采集與處理

養(yǎng)殖試驗結束后各組試驗魚饑餓24 h后采樣。統(tǒng)計每缸魚的總數(shù)、稱總重后，隨機取3尾魚-40℃冷凍保存，用于體成分分析;另隨機取3尾魚用濃度為100 mg/L的MS-222(化學名稱:間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽)麻醉，稱重、量體長后尾靜脈取血，全血置于一次性試管中于4℃冰箱中靜置1～2 h，3 500 r/min離心30 min，取上層血清分裝于1.5 mL離心管中，暫存于-20℃冰箱用于血清生化指標的測定;取內臟團和肝胰臟稱重。計算出各組試驗魚的增重率、蛋白質效率、肝體指數(shù)、臟體指數(shù)、肥滿度、飼料系數(shù)，各指標計算公式如下:

1.4.2 指標測定

水分含量的測定采用105℃烘箱干燥恒重法(GB/T 5009.3—2003);粗蛋白質含量的測定采用凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2003);粗脂肪含量的測定采用索氏抽提法(GB/T 5009.6—2003);粗灰分含量的測定采用550℃高溫灼燒法(GB/T 5009.4—2003)。

將制備好的血清樣品送至黑龍江省電力醫(yī)院，采用貝克曼ProCX4全自動生化分析儀進行測定。各指標測定方法如下:總蛋白(TP)含量的測定采用雙縮脲法;白蛋白(ALB)含量的測定采用溴甲酚綠法;球蛋白(GLB)含量經(jīng)計算得出，為TP與ALB含量的差值;谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)活性的測定采用速率法;甘油三酯(TG)和總膽固醇(TCHO)含量的測定采用酶法;堿性磷酸酶(ALP)活性的測定采用比色法;肌酐(CREA)含量的測定采用酶法;尿酸(UA)含量的測定采用磷鎢酸還原法。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件分析，以蛋白質水平和AKG濃度為影響因素，采用雙因素方差分析和Duncan氏法多重比較進行統(tǒng)計，顯著水平設定為P＜0.05。試驗結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白質水平飼料中添加AKG對松浦鏡鯉生長性能的影響

由表2可以看出，各個蛋白質水平下，飼料中添加AKG均有提高松浦鏡鯉增重率、蛋白質效率和降低飼料系數(shù)的趨勢，除34%蛋白質水平下松浦鏡鯉增重率顯著提高(P＜0.05)外，其余差異不顯著(P＞0.05)。28%、31%、34%和37%蛋白質水平下，0.75%和1.50%AKG組增重率分別比對照組(未添加AKG組)提高了10.71%和29.95%、5.49%和17.37%、42.04%和23.71%、2.41%和-9.27%，飼料系數(shù)降低了-9.58%和5.39%、6.67%和 9.63%、6.29%和 5.59%、1.60%和4.80%。各個蛋白質水平下，飼料中添加AKG對松浦鏡鯉肝體指數(shù)、臟體指數(shù)和肥滿度均無顯著影響(P＞0.05)。就松浦鏡鯉的生長性能而言，蛋白質水平和AKG濃度之間不存在顯著的交互作用(P＞0.05)。

表2 不同蛋白質水平飼料中添加AKG對松浦鏡鯉生長性能的影響Table 2 Effects of AKG supplementation in different protein level diets on growth performance of Songpu mirror carp

2.2 不同蛋白質水平飼料中添加AKG對松浦鏡鯉體成分的影響

由表3可以看出，各個蛋白質水平下，飼料中添加AKG對松浦鏡鯉全魚體成分均無顯著影響(P＞0.05)。蛋白質水平和AKG濃度的交互作用除對全魚粗灰分含量有顯著影響(P＜0.05)外，對其他體成分指標均無顯著影響(P＞0.05)。

2.3 不同蛋白質水平飼料中添加AKG對松浦鏡鯉血清生化指標的影響

由表4可以看出，AKG顯著影響血清ALT、AST活性及UA、TG含量(P＜0.05)。蛋白質水平和AKG濃度的交互作用除對血清UA和TG含量有顯著影響(P＜0.05)外，對其他各指標均無顯著影響(P＞0.05)。28%蛋白質水平下，1.50%AKG組血清TG含量顯著低于對照組(P＜0.05)，與0.75%AKG組差異不顯著(P＞0.05)。31%蛋白質水平下，1.50%AKG組血清ALB含量和ALT活性顯著高于其他組(P＜0.05);0.75%和1.50%AKG組血清UA和TG含量顯著低于對照組(P＜0.05)。34%蛋白質水平下，0.75%AKG組血清TP和TG含量顯著高于對照組(P＜0.05)。37%蛋白質水平下，1.50%AKG組血清ALT活性和UA含量顯著高于其他組(P＜0.05);0.75%和1.50%AKG組血清AST活性顯著高于對照組(P＜0.05)。各個蛋白質水平下，飼料中添加AKG對血清GLB、TCHO、CREA含量及ALP活性均無顯著影響(P＞0.05)。

3 討論

3.1 不同蛋白質水平飼料中添加AKG對松浦鏡鯉生長性能的影響

目前，AKG對畜禽生產(chǎn)性能影響的報道較多。胡泉州等［7］研究表明，飼料添加1%AKG可以促進仔豬生長并減弱免疫應激對仔豬生長性能的影響。余親平等［8］研究得出，在肉仔雞飼糧中添加0.7%AKG可顯著提高2周齡的體重及1～2周齡的平均日增重，其促生長效果優(yōu)于0.7%谷氨酰胺。王金泉等［9］研究發(fā)現(xiàn)，中草藥和AKG聯(lián)合使用比單獨使用對斷奶仔豬的促生長效果更明顯，飼料回報率更高。此外，研究還表明，飼糧中添加能顯著緩解脂多糖應激對斷奶仔豬生長的抑制作用［10］。

表3 不同蛋白質水平飼料中添加AKG對松浦鏡鯉體成分的影響Table 3 Effects of AKG supplementation in different protein level diets on body composition of Songpu mirror carp%

表4 不同蛋白質水平飼料中添加AKG對松浦鏡鯉血清生化指標的影響Table 4 Effects of AKG supplementation in different protein level diets on serum biochemical indices of Songpu mirror carp

續(xù)表4

目前未見AKG在水產(chǎn)動物生產(chǎn)中應用的報道。本試驗條件下，不同蛋白質水平下，飼料中添加AKG對松浦鏡鯉生長性能的影響不盡相同，可能與谷氨酰胺為條件性必需氨基酸有關。28%、31%和34%蛋白質水平下，添加AKG的各組松浦鏡鯉的增重率與對照組相比均有所提高，其中，34%蛋白質水平下0.75%AKG組松浦鏡鯉增重率顯著高于對照組;37%蛋白質水平下，1.50%AKG組松浦鏡鯉增重率反而低于對照組。這可能是因為AKG直接用于氧化供能或直接排出體外而沒有用于體增長。目前，未見關于AKG對水生動物營養(yǎng)利用率的報道，但在陸生動物上有相關報道。王金泉等［9］研究表明，AKG可以促進飼糧中營養(yǎng)物質的吸收，對促進斷奶仔豬的生長具有協(xié)同作用。本試驗條件下，在飼料能量和蛋白質水平基本相同的情況下，隨AKG濃度的增加飼料蛋白質效率有增加趨勢，飼料系數(shù)有降低趨勢，說明飼料中添加AKG對飼料利用有積極作用。

3.2 不同蛋白質水平飼料中添加AKG對松浦鏡鯉體成分的影響

Yao等［11］研究表明AKG可以促進蛋白質的合成，而本試驗條件下，魚體的粗蛋白質含量相對穩(wěn)定，受飼料AKG濃度影響較小，其原因可能為Yao等［11］的研究是以體外培養(yǎng)的豬腸道上皮細胞為研究對象，結果顯示AKG可以促進細胞蛋白質合成，而本試驗是以魚體為研究對象，AKG促進細胞合成的蛋白質并沒有用于魚體蛋白質的沉積。其具體代謝機制有待于進一步研究。

3.3 不同蛋白質水平飼料中添加AKG對松浦鏡鯉血清生化指標的影響

血清TP包括ALB和GLB，具有運輸多種代謝產(chǎn)物，維持血管內正常膠體滲透壓和酸堿度等多種生理功能。本試驗條件下，31%蛋白質水平下，飼料添加1.50%AKG可以顯著提高血清中ALB含量;34%蛋白質水平下，飼料添加0.75%AKG可以顯著提高血清中TP和GLB含量。這表明，一定蛋白質水平下，飼料添加AKG可以促進松浦鏡鯉蛋白質的合成。這與黃冠慶等［12］在雞上的研究結果一致。血清中非蛋白質類含氮物主要包括尿素、UA等，其含量可以反映體內蛋白質分解代謝和腎功能情況，當飼料氨基酸平衡時，血清尿素氮及UA含量下降［13］。本試驗條件下，飼料添加AKG后松浦鏡鯉血清中UA含量均有不同程度的降低，表明飼料添加AKG有利于氨基酸平衡，有利于蛋白質代謝。ALT和AST是動物體內最主要的2個轉氨酶，在氨基酸代謝方面發(fā)揮重要作用，是反映蛋白質代謝利用率的重要指標［14］。當飼料中蛋白質水平升高時，氨基酸代謝強度增加，從而造成轉氨酶活性升高［15］。本試驗中，飼料中添加AKG可以顯著提高血清中ALT和AST活性，表明飼料中添加AKG有利于促進松浦鏡鯉肝胰臟氨基酸代謝，提高蛋白質利用率，促進蛋白質合成。以上結果表明，飼料中添加一定量的AKG可以促進松浦鏡鯉蛋白質代謝。

TG和TCHO的含量反映了動物體內脂肪沉積的情況［16］。低蛋白質水平(28%、31%)下飼料添加AKG可以顯著降低血清中TG含量，而高蛋白質水平(34%、37%)下飼料添加AKG雖有升高血清中TG含量的趨勢，但差異不顯著，以上結果表明在低蛋白質水平飼料中添加AKG有利于降低松浦鏡鯉血脂，利于魚體健康。CREA是肌肉組織中儲能物質肌酸代謝的終產(chǎn)物，血清CREA的含量能反映腎臟的排泄功能。血清中的ALP主要來自骨骼，由成骨細胞產(chǎn)生。ALP經(jīng)肝膽系統(tǒng)進行排泄。所以當ALP產(chǎn)生過多或排泄受阻時，均可使血中ALP活性發(fā)生變化。本試驗條件下，飼料中添加AKG未對血清中CREA含量、ALP活性產(chǎn)生顯著影響，表明飼料中添加AKG未對松浦鏡鯉產(chǎn)生負面影響。

4 結論

飼料中添加適量的AKG可以在一定程度上提高松浦鏡鯉的增重率和蛋白質效率，降低飼料系數(shù)，促進魚體蛋白質和脂肪代謝。

［1］譚文軍，吳金生.谷氨酰胺的代謝及在腸外營養(yǎng)液中應用的進展［J］.腸外與腸內營養(yǎng)，2001，8(1):41-43.

［2］WU G，MEIER S A，KNABE D A.Dietary glutamine supplementation prevents jejunal atrophy in weaned pigs［J］.The Journal of Nutrition，1996，126(10):2578-2584.

［3］KRISTENSEN N B，JUNGVID H，F(xiàn)ERNANDEZ J A，et al.Absorption and metabolism ofα-ketoglutarate in growing pigs［J］.Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition，2002，86(7/8):239-245.

［4］HOU Y Q，WANG L，DING B Y，et al.Dietaryα-ketoglutarate supplementation ameliorates intestinal injury in lipopolysaccharide-challenged piglets［J］.Amino Acids，2010，39(2):555-564.

［5］BUDDINGTON R K，PAJOR A，BUDDINGTON K K，et al.Absorption ofα-ketoglutarate by the gastrointestinal tract of pigs［J］.Comparative Biochemistry and Physiology，Part A:Molecular＆Integrative Physiology，2004，138(2):215-220.

［6］SEGAUD F，COMBARET L，NEVEUX N，et al.Effects of ornithineα-ketoglutarate on protein metabolism in Yoshida sarcoma-bearing rats［J］.Clinical Nutrition，2007，26(5):624-630.

［7］胡泉州，侯永清，丁斌鷹，等.α-酮戊二酸對仔豬小腸組織學形態(tài)與功能的影響［J］.動物營養(yǎng)學報，2008，20(6):662-667.

［8］余親平，陳雁群，謝金蟬，等.日糧添加α-酮戊二酸對肉仔雞生長性能及組織器官發(fā)育的影響［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(10):10-14.

［9］王金泉，項方獻，姚剛.中草藥結合AKG對斷奶仔豬生長及消化吸收功能的影響［J］.西北農(nóng)林科技大學學報:自然科學版，2011，39(5):27-31.

［10］劉堅，侯永清，丁斌鷹，等.α-酮戊二酸對脂多糖應激斷奶仔豬生長抑制的緩解作用［J］.動物營養(yǎng)學報，2009，21(4):519-524.

［11］YAO K，YIN Y L，LI X L，et al.Alpha-ketoglutarate inhibits glutamine degradation and enhances protein synthesis in intestinal porcine epithelial cells［J］.Amino Acids，2012，42(6):2491-2500.

［12］黃冠慶，余親平，陳雁群，等.α-酮戊二酸對黃羽肉雞飼料代謝能和蛋白質代謝的影響［J］.中國飼料，2012(18):22-24.

［13］李忠榮，陳婉如，葉鼎承，等.低蛋白質補充氨基酸飼糧對北京鴨生長性能、血清生化指標及糞氮含量的影響［J］.動物營養(yǎng)學報，2013，25(2):319-325.

［14］唐玲，徐奇友，王常安，等.不同水溫和飼料蛋白質水平對鏡鯉血清生化指標的影響［J］.大連海洋大學學報，2011，26(1):41-46.

［15］ABDEL-TAWWAB M，AHMAD M H，KHATTAB Y A，et al.Effect of dietary protein level，initial body weight，and their interaction on the growth，feed utilization，and physiological alterations of Nile tilapia，Oreochromis niloticus(L.)［J］.Aquaculture，2010，298(3/4):267-274.

［16］姜柯君，王際英，張利民，等.飼料中添加小肽對星斑川鰈幼魚生長性能、體組成及血清生化指標的影響［J］.動物營養(yǎng)學報，2013，25(1):222-230.