左歸丸含藥血清通過p38 MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的分化

劉立萍 任艷玲 李 然 王智民 趙金茹 蒿長(zhǎng)英 宋 囡

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110847)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)是以骨量減少、骨組織微觀結(jié)構(gòu)改變，骨脆性增強(qiáng)，骨折發(fā)生率高為特征的臨床常見病癥，對(duì)于PMOP的防治日益受到人們的關(guān)注，現(xiàn)代研究表明中醫(yī)藥在PMOP的藥物治療方面取得了不少成果〔1〕。左歸丸具有滋陰補(bǔ)腎、填精益髓作用，本課題組前期研究結(jié)果表明左歸丸對(duì)去卵巢所致PMOP大鼠有一定防治作用〔2〕。為了進(jìn)一步探討左歸丸治療PMOP的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)探討p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)左歸丸含藥血清調(diào)控MC3T3-E1成骨細(xì)胞分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 SPF級(jí)SD雌性大鼠60只，(200±20)g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào):SCXK(滬)2008-0016。MC3T3-E1 Subclone 14，由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院提供。MC3T3-E1成骨細(xì)胞用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每周換2次培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。

1.2 藥物與試劑 左歸丸(上海雷允上封浜制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z31020371);倍美力結(jié)合雌激素片(愛爾蘭惠氏藥廠，國(guó)藥準(zhǔn)字 J20050120)，SB203580、PNPP、茜素紅(Sigma)，抗ALP抗體(博士德)，抗GAPDH抗體(北京中杉)。

1.3 主要儀器 iMark型酶標(biāo)儀(Bio-Rad);Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad);EC3凝膠成像儀(UVP)。

1.4 方法

1.4.1 含藥血清的制備 大鼠按體重隨機(jī)分為3組，空白對(duì)照組、左歸丸組、倍美力組，20只/組。根據(jù)人與大鼠等劑量換算公式折算大鼠左歸丸的等臨床劑量為1.6 g/kg體重，倍美力為56.25 μg/kg。藥物灌服10 ml/kg，空白對(duì)照組灌服蒸餾水，2次/d，于第8天給藥2 h后，麻醉，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置2 h，離心20 min，取血清，56 ℃滅活30 min，過濾除菌，－80 ℃保存。

1.4.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 p38 MAPK特異阻滯劑SB203580(10 μmol/L)用DMSO(濃度＜0.1%)溶解。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(Control)、SB203580組(SB)、左歸丸組(ZG)、左歸丸加SB203580組(ZG+SB)、倍美力組(BML)、倍美力加SB203580組(BML+SB)。

1.4.3 堿性磷酸酶活性測(cè)定 以1×105接種于48孔培養(yǎng)板，24 h后，換用含0.2%FBS的α-MEM培養(yǎng)液饑餓24 h，棄培養(yǎng)液，加入不含或含10 μmol/L SB203580的α-MEM培養(yǎng)液，170 μl/孔，預(yù)處理 60 min。各組加入相應(yīng)的含藥血清，30 μl/孔，孵育48 h。0.1%Triton X-100裂解液，4℃作用過夜，轉(zhuǎn)入－20℃，室溫解凍，反復(fù)凍融3次，冰水浴內(nèi)超聲，收集裂解液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。采用PNPP法測(cè)定裂解產(chǎn)物中的堿性磷酸酶活性，測(cè)定孔內(nèi)加入基質(zhì)溶液，100 μl/孔，充分混勻37℃孵育15 min，加入0.5 mol/L NaOH 終止反應(yīng)，80 μl/孔，混勻，酶標(biāo)儀上415 nm測(cè)定光密度值。

1.4.4 改良鈣鈷法染色 以1×105接種于24孔板，融合達(dá)80%，換用含0.2%FBS的α-MEM培養(yǎng)液饑餓24 h，棄培養(yǎng)液，加入不含或含10 μmol/L SB203580的 α-MEM培養(yǎng)液，340 μl/孔，預(yù)處理60 min。各組加入相應(yīng)的含藥血清，60 μl/孔，孵育7 d，每3 d換1次液。95%酒精固定10 min，PBS洗，加入孵育液，37℃ 孵育4 h，去離子水沖洗，2%硝酸鈷溶液5 min，去離子水沖洗，1%硫化銨溶液1 min，去離子水沖洗。

1.4.5 礦化作用分析 孵育14 d，余同1.4.4。95%酒精固定10 min，PBS洗，0.1%茜素紅-Tris-Hcl(pH8.3)37℃，避光孵育30 min，去離子水沖洗。

1.4.6 Western印跡分析 以2×106接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，融合達(dá)80%，換用含0.2%FBS的α-MEM培養(yǎng)液饑餓24 h，換用不含或含10 μmol/L SB203580的 α-MEM 培養(yǎng)液5.1 ml，預(yù)孵育60 min后，各組加入相應(yīng)的含藥血清，0.9 ml/瓶，孵育48 h。提取總蛋白，BCA測(cè)定蛋白濃度，提取液中加入5×SDS上樣緩沖液，100℃變性5 min，上樣每孔含60 μg蛋白，12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜3 h，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h。一抗4℃孵育過夜，二抗山羊抗兔HRP 37℃孵育2 h，ECL發(fā)光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Quantity one軟件分析，掃描光密度值。采用所測(cè)ALP蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的光密度比值來表示ALP蛋白的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件處理，用One-Way ANOVA進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 p38阻滯劑對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)MC3T3成骨細(xì)胞ALP活性和礦化作用的影響 與Control組比較，ZG組和BML組顯著增強(qiáng)MC3T3-E1成骨細(xì)胞ALP活性和礦化作用(P＜0.01);與ZG組比較，ZG+SB組明顯抑制左歸丸含藥血清對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞ALP活性和礦化沉積的誘導(dǎo)作用(P＜0.01)，且ZG組優(yōu)于BML組(P＜0.05);與BML組比較，BML+SB組顯著抑制倍美力含藥血清誘導(dǎo)的MC3T3-E1成骨細(xì)胞的ALP活性和礦化沉積(P＜0.01)。見表1。

2.2 p38抑制劑對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)MC3T3-E1成骨細(xì)胞ALP蛋白表達(dá)的影響 與Control組(1)比較，ZG組和BML組均促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞ALP蛋白的表達(dá)(2.395±0.072，1.938±0.023，P＜0.01);與ZG組比較，ZG+SB組顯著對(duì)抗左歸丸含藥血清誘導(dǎo)MC3T3-E1成骨細(xì)胞ALP蛋白的高表達(dá)(1.233±0.058，P＜0.01)，ZG 組優(yōu)于 BML組(P＜0.01);與BML組比較，BML+SB組顯著下調(diào) ALP蛋白表達(dá)水平(1.090±0.035，P＜0.01)。SB組 ALP蛋白表達(dá)為1.003±0.066。見圖1。

表1 p38 MAPK通路對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性和礦化作用的影響(±s)

表1 p38 MAPK通路對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性和礦化作用的影響(±s)

與Control組比較:1)P＜0.01;與 ZG組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01;與BML組比較:4)P＜0.01

組別ALP活性(n=5，nmol·min －1·mg－1)ALP活性(n=3，%)礦化作用(n=3，%)Control 0.247±0.018 1 1 SB 0.185±0.0121) 0.444±0.0731) 0.492±0.0521)ZG 0.477±0.0191) 2.930±0.1241) 3.957±0.0621)ZG+SB 0.355±0.0181)3) 1.717±0.1481)3) 1.050±0.0663)BML 0.381±0.0201)3) 2.763±0.0561)2) 2.967±0.0681)3)BML+SB 0.286±0.0121)4) 1.629±0.0731)4) 1.099±0.0734)

圖1 p38抑制劑對(duì)左歸丸含藥血清干預(yù)MC3T3-E1成骨細(xì)胞ALP蛋白表達(dá)的影響(± s，n=3)

3 討論

PMOP屬于中醫(yī)“骨痿”、“骨痹”范疇，絕經(jīng)后婦女腎氣衰，天癸竭，骨失所養(yǎng)，臨床治療以中醫(yī)“腎主骨”為基本指導(dǎo)理論，以補(bǔ)腎法為主要治療法則，選用補(bǔ)腎方藥防治PMOP。左歸丸作為具有補(bǔ)腎作用的代表方劑，能夠有效防治PMOP〔2～4〕。

成骨細(xì)胞分化參與骨形成，包括Ⅰ型膠原積累，ALP和骨鈣素表達(dá)，礦化作用形成礦化結(jié)節(jié)。成骨細(xì)胞增殖受抑制及其分化程度降低，將直接導(dǎo)致骨形成減少，引發(fā)骨質(zhì)疏松〔5〕，刺激成骨細(xì)胞增殖并促進(jìn)其分化成熟是防治骨質(zhì)疏松的主要方法〔6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明左歸丸含藥血清能夠增強(qiáng)MC3T3-E1成骨細(xì)胞ALP活性和礦化作用，上調(diào)ALP蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞分化，參與骨形成，從而有效防治PMOP。

p38 MAPK是促分裂原活化蛋白激酶的亞科，在成骨細(xì)胞分化中起著重要作用〔7〕，抗骨質(zhì)疏松藥增強(qiáng)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的分化和礦化作用〔8〕，甲狀旁腺激素能夠通過p38 MAPK通路促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成〔9〕，SB203580阻滯p38主要與減少ALP活性相關(guān)〔10〕。本研究結(jié)果表明SB203580阻滯p38 MAPK通路減少ALP活性和礦化作用，下調(diào)ALP蛋白的表達(dá)水平，抑制左歸丸含藥血清對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用，提示左歸丸含藥血清可能部分通過p38 MAPK通路影響MC3T3-E1成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨生成，這可能是左歸丸有效防治PMOP的作用機(jī)制之一。對(duì)于左歸丸含藥血清是否依賴ERK和JNK通路影響成骨細(xì)胞分化，不同MAPK通路對(duì)左歸丸含藥血清促進(jìn)成骨細(xì)胞分化作用的影響是否相同值得我們進(jìn)一步研究。

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