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      加工方法對(duì)百合質(zhì)量的影響研究△

      2013-09-26 10:12:46聶慧嚴(yán)輝錢大瑋段金廒歐陽臻錢葉飛管漢亮
      中國現(xiàn)代中藥 2013年4期
      關(guān)鍵詞:甘油酯百合批號(hào)

      聶慧,嚴(yán)輝,錢大瑋*,段金廒,歐陽臻,錢葉飛,管漢亮

      (1.江蘇大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210046)

      中藥工業(yè)

      加工方法對(duì)百合質(zhì)量的影響研究△

      聶慧1,2,嚴(yán)輝2,錢大瑋2*,段金廒2,歐陽臻1,錢葉飛2,管漢亮2

      (1.江蘇大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210046)

      目的:研究加工方法對(duì)百合質(zhì)量的影響,為百合加工方法的規(guī)范化提供參考依據(jù)。方法:新鮮百合樣品分別采用煮制和蒸制2種燙片方法、不同干燥方法(包括熱風(fēng)烘干、微波干燥、遠(yuǎn)紅外干燥和冷凍干燥)進(jìn)行加工,樣品中酚性甘油酯類、核苷、氨基酸及多糖等成分分別采用超高效液相-二極管陣列檢測器(UPLC-DAD)、超高效液相-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-TQ/MS)及紫外-可見分光光度法(UV)測定。結(jié)果:燙片過程,煮5~8 min和蒸8~10 min樣品不僅外觀色澤較佳,而且各成分含量較高;干燥方法,60~80 ℃烘干和冷凍干燥法較好。結(jié)論:燙片是百合干加工過程中必不可少的環(huán)節(jié);確定最佳工藝條件為煮5~8 min,60~80 ℃烘干或冷凍干燥。

      百合;燙片;干燥;工藝優(yōu)化

      百合味甘,性寒。具有養(yǎng)陰潤肺,清心安神功能,用于陰虛燥咳、虛煩驚悸、失眠多夢、精神恍惚[1-2]?,F(xiàn)代研究表明,百合含酚性甘油酯、多糖、甾體皂苷和生物堿等活性成分,具有抗疲勞、抗腫瘤、降血糖、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜及抗應(yīng)激損傷作用[3]。此外還含有氨基酸、核苷、微量元素、揮發(fā)油及磷脂等營養(yǎng)成分,常作為飲料及營養(yǎng)保健食品的基質(zhì)原料應(yīng)用于食品工業(yè)[4]。

      百合多以百合干的形式貯藏與應(yīng)用。傳統(tǒng)百合干加工流程為:鮮百合選料→剝片→清洗→燙片→冷卻→干燥→包裝儲(chǔ)藏。加工過程中燙片和干燥2個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)其質(zhì)量的影響較大,本研究以鮮百合為材料,研究燙片工藝與干燥過程中百合化學(xué)成分的變化,以優(yōu)化各加工參數(shù),為優(yōu)質(zhì)百合的生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

      1 儀器與試藥

      1.1 儀器

      ACQUITY UPLC系統(tǒng)(二元高壓泵,自動(dòng)進(jìn)樣器,柱溫箱,二極管陣列檢測器,Waters公司);Xevo TQ質(zhì)譜系統(tǒng)(Waters公司);MassLynxTM質(zhì)譜工作站(Waters公司);UV-2000紫外-可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司);Sartorius BT125D電子分析天平(德國塞利多斯公司);EPED超純水系統(tǒng)(南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司);KQ-250E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);Anke GL-16GⅡ型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

      1.2 試藥及試劑

      1-O-阿魏酰甘油(Fer)、1-O-p-香豆酰甘油(Cou)、王百合苷D(Reg D)、王百合苷C(Reg C)、王百合苷A(Reg A)、王百合苷E(Reg E)均為本實(shí)驗(yàn)室從百合鱗葉中分離自制,其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR、13C-NMR及ESI-MS分析確認(rèn),純度經(jīng)HPLC-UV檢測均大于98%。

      鳥嘌呤(Gua,批號(hào):140631-200904)、黃嘌呤(Xan,批號(hào):140662-200301)、胸腺嘧啶(Thym,批號(hào):140708-200401)、腺嘌呤(Ade,批號(hào):886-200001)、肌苷(Ino,批號(hào):140669-200903)、環(huán)磷酸腺苷(Camp,批號(hào):140709-200602)和葡萄糖(Glc,批號(hào):0833-9501)購自中國食品藥品檢定研究院,供含量測定用。

      胞苷(Cytd,批號(hào):0001446223)、2′-脫氧胞苷(2′B,批號(hào):1000851526)、2′-脫氧腺苷(2′X,批號(hào):1000723530)、2′-脫氧鳥苷(2′Niao,批號(hào):1000814345)、2′-脫氧尿苷(2′N,批號(hào):1000943453)、胸苷(Thyd,批號(hào):1000735425)、甘氨酸(Gly)、γ-氨基丁酸(GABA)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、丙氨酸(Ala)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、瓜氨酸(Cit)、脯氨酸(Pro)、纈氨酸(Val)、酪氨酸(Tyr)、羥脯氨酸(Hpro)、異亮氨酸(Ile)、組氨酸(Hit)、精氨酸(Arg)購自Sigma公司,其純度經(jīng)HPLC檢測均大于98%;乙腈(德國Merck公司)為色譜純,其他試劑均為分析純。

      實(shí)驗(yàn)用百合樣品于2012年10月采自安徽省霍山縣,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為百合科植物卷丹LiliumlancifoliumThunb.的新鮮肉質(zhì)鱗葉。憑證標(biāo)本存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

      2 方法與結(jié)果

      2.1 樣品制備

      新鮮百合樣品,經(jīng)選料、剝片、清洗后分別進(jìn)行燙片工藝和干燥方法研究。樣品信息見表1、2。

      表1 燙片樣品信息表

      注:A1為鮮品

      表2 干燥樣品信息表

      注:B1~B7為鮮品,B8~B14為煮制品

      2.2 酚性甘油酯類成分測定[5-6]

      2.2.1 供試品溶液的制備

      2.2.1.1 燙片樣品供試品溶液的制備 取樣品約3 g,精密稱定,加適量50%乙醇,勻漿,置于具塞錐形瓶,加50%乙醇約60 mL,靜置2 h,室溫超聲30 min,轉(zhuǎn)移并定容至100 mL,搖勻,溶液離心10 min(13 000 r·min-1)。取上清液適量,經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。同時(shí)測定樣品水分。

      2.2.1.2 干燥樣品供試品溶液的制備 取樣品粉末0.5 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶,加50%乙醇約60 mL,靜置2 h,室溫超聲30 min,轉(zhuǎn)移并定容至100 mL,搖勻,離心10 min(13 000 r·min-1)。取上清液適量,經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜濾過后,取續(xù)濾液作為供試品溶液。同時(shí)測定樣品水分。

      2.2.2 色譜分析條件 色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)。流動(dòng)相:A-乙腈,B-0.1%甲酸水溶液,梯度洗脫(0~2 min,3%~3% A;2~6 min,3%~10% A;6~9 min,10%~15% A;9~12 min,15%~15% A;12~16 min,15%~25% A)。流速:0.4 mL·min-1,柱溫:35 ℃。

      2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取干燥至恒重的酚性甘油酯對(duì)照品適量,加甲醇制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。取不同體積的上述儲(chǔ)備液加甲醇稀釋后,制成不同濃度的對(duì)照品溶液,按照2.2.2項(xiàng)色譜條件,注入U(xiǎn)PLC儀進(jìn)行測定,各成分線性范圍分別為:Fer,13.70~137.0 μg·mL-1(r=0.999 8);Cou,15.00~150.0 μg·mL-1(r=0.999 5);Reg D,1.65~16.50 μg·mL-1(r=0.999 8);Reg C,10.00~100.0 μg·mL-1(r=0.999 7);Reg A,20.30~203.0 μg·mL-1(r=0.999 9);Reg E,1.16~11.60 μg·mL-1(r=0.999 9)。

      2.2.4 樣品測定 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各3 μL,注入U(xiǎn)PLC儀測定,總酚性甘油酯含量為各酚性甘油酯含量之和。結(jié)果見表3、4。

      2.3 核苷測定[7-9]

      2.3.1 供試品溶液的制備

      2.3.1.1 燙片樣品供試品溶液的制備 取樣品約3 g,精密稱定,加適量60%乙醇,勻漿,置于具塞錐形瓶,加60%乙醇約40 mL,靜置30 min,熱提(70 ℃)1 h,待溶液冷卻至室溫,轉(zhuǎn)移并定容至50 mL,搖勻,溶液離心10 min(13 000 r·min-1)。取上清液適量,經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。同時(shí)測定樣品水分。

      2.3.1.2 干燥樣品供試品溶液的制備 取0.5 g樣品粉末,精密稱定,置于具塞錐形瓶,加60%乙醇約40 mL,靜置30 min,熱提(70 ℃)1 h,待溶液冷卻至室溫,轉(zhuǎn)移并定容至50 mL,搖勻,溶液離心10 min(13 000 r·min-1)。取上清液適量,經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。同時(shí)測定樣品水分。

      2.3.2 色譜分析條件 色譜柱:ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)。流動(dòng)相:A-含10 mmol·L-1醋酸胺和0.8%醋酸的水溶液,B-含0.05%醋酸乙腈溶液,梯度洗脫(0~6 min,10%~10% A;6~8 min,10%~40% A;8~9 min,40%~40% A;9~11 min,40%~50% A)。流速:0.4 mL·min-1,柱溫:35 ℃。

      2.3.3 質(zhì)譜檢測條件 離子化模式:ESI+;檢測方式:多反應(yīng)檢測(MRM);毛細(xì)管電壓:3.0 kV;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:550 ℃;脫溶劑氣流量:1 000 L·h-1;錐孔氣流量:50 L·h-1;碰撞氣流量:0.15 mL·min-1。

      2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取核苷對(duì)照品適量,加10%甲醇制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。取不同體積的上述儲(chǔ)備液加10%甲醇稀釋后,制成不同濃度的對(duì)照品溶液,按照2.3.2項(xiàng)色譜條件,注入U(xiǎn)PLC儀進(jìn)行測定,各成分線性范圍分別為:Gua,0.18~17.80 μg·mL-1(r=0.999 6);Xan,0.09~9.20 μg·mL-1(r=0.999 9);Thym,0.13~13.40 μg·mL-1r=0.999 5);Ade,0.12~12.30 μg·mL-1(r=0.999 6);Ino,0.14~14.30 μg·mL-1(r=0.999 8);Camp,0.08~8.20 μg·mL-1(r=0.999 4);Cytd,0.14~13.90 μg·mL-1(r=0.999 1);2′B,0.10~10.00 μg·mL-1(r=0.999 6);2′X,0.17~16.50 μg·mL-1(r=0.999 8);2′Niao,0.14~14.00 μg·mL-1(r=0.999 2);2′N,0.11~10.90 μg·mL-1(r=0.999 2);Thyd,0.13~13.30 μg·mL-1(r=0.999 9)。

      2.3.5 樣品測定 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各1 μL,注入U(xiǎn)PLC儀測定,總核苷含量為各核苷含量之和。結(jié)果見表3、4。

      2.4 氨基酸的測定[10]

      2.4.1 供試品溶液的制備 樣品供試品溶液制備方法參照2.3.1項(xiàng)。

      2.4.2 色譜分析條件 色譜柱:ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)。流動(dòng)相:A-含5 mmol·L-1甲酸胺、5 mmol·L-1醋酸胺和0.2%甲酸水溶液,B-含1 mmol·L-1甲酸胺、1 mmol·L-1醋酸胺和0.2%甲酸乙腈溶液,梯度洗脫(0~6 min,15%~20% A;6~10 min,20%~30% A;10~11 min,30%~46% A)。流速:0.4 mL·min-1,柱溫:35 ℃。

      2.4.3 質(zhì)譜檢測條件 參照2.3.3項(xiàng)。

      2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取氨基酸對(duì)照品適量,加水制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。取不同體積的上述儲(chǔ)備液加水稀釋后,制成不同濃度的對(duì)照品溶液,按照2.4.2項(xiàng)色譜條件,注入U(xiǎn)PLC儀進(jìn)行測定,各成分線性范圍分別為:Gly,0.28~27.60 μg·mL-1(r=0.999 1);GABA,0.26~26.40 μg·mL-1(r=0.999 6);Leu,0.21~21.20 μg·mL-1(r=0.999 8);Met,0.25~25.20 μg·mL-1(r=0.999 6);Phe,0.15~15.20 μg·mL-1(r=0.999 4);Trp,0.21~20.80 μg·mL-1(r=0.999 5);Ala,0.22~22.40 μg·mL-1(r=0.999 8);Thr,0.22~22.00 μg·mL-1(r=0.999 9);Ser,0.27~27.20 μg·mL-1(r=0.999 9);Asn,0.26~26.00 μg·mL-1(r=0.999 7);Gln,0.17~16.80 μg·mL-1(r=0.999 7);Glu,0.28~27.60 μg·mL-1(r=0.999 6);Cit,0.16~15.60 μg·mL-1(r=0.999 6);Pro,0.26~26.40 μg·mL-1(r=0.999 6);Val,0.15~15.20 μg·mL-1(r=0.999 5);Tyr,0.09~9.20 μg·mL-1(r=0.999 5);Hpro,0.13~12.80 μg·mL-1(r=0.999 9);Ile,0.23~22.80 μg·mL-1(r=0.999 9);Hit,0.28~27.60 μg·mL-1(r=0.999 9);Arg,0.16~15.60 μg·mL-1(r=0.999 9)。

      2.4.5 樣品測定 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各1 μL,注入U(xiǎn)PLC儀測定,總氨基酸含量為各氨基酸含量之和。結(jié)果見表3、4。

      2.5 多糖測定[11]

      2.5.1 供試品溶液的制備

      2.5.1.1 燙片樣品供試品溶液的制備 取樣品約3 g,精密稱定,加適量80%乙醇,勻漿,置于具塞錐形瓶,加80%乙醇約40 mL,靜置2 h,室溫超聲30 min。離心10 min(3 000 r· min-1),棄上清液,沉淀以少量80%乙醇洗滌2次。沉淀轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中,加水約80 mL,100 ℃回流2 h,待溶液冷卻至室溫,轉(zhuǎn)移并定容至100 mL,搖勻,溶液離心10 min(13 000 r·min-1)。精密量取上清液1 mL,以水定容至10 mL,搖勻即得。同時(shí)測定樣品水分。

      2.5.1.2 干燥樣品供試品溶液的制備 取樣品粉末(40目)約0.5 g,精密稱定,加80%乙醇約40 mL,靜置2 h,室溫超聲30 min。離心10 min(3 000 r·min-1),棄上清液,沉淀以少量80%乙醇洗滌2次。沉淀轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中,加水約40 mL,100 ℃回流2 h,待溶液冷卻至室溫,轉(zhuǎn)移并定容至100 mL,搖勻,溶液離心10 min(13 000 r·min-1)。精密量取上清液1 mL,以水定容至10 mL,搖勻即得。同時(shí)測定樣品水分。

      2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對(duì)照品適量,置量瓶中,加水制成葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述儲(chǔ)備液0.1,0.3,0.5,0.7,0.9,1.0 mL,分別置10 mL具塞試管中,加水至1.0 mL,搖勻,精密加入5%苯酚溶液2.0 mL,混勻,精密加入濃硫酸7.0 mL,混勻,置沸水浴中加熱20 min,水浴冷卻5 min后,于488 nm處測吸光度。準(zhǔn)確量取水1.0 mL,自“精密加入5%苯酚”起,同法操作,作空白對(duì)照。線性范圍為20.10~201.0 μg·mL-1(r=0.998 7)。

      2.5.3 樣品測定 取供試品溶液0.5 mL,按照2.5.2項(xiàng)“加水至1.0 mL,……于488 nm處測吸光度”測定多糖含量,結(jié)果見表3、4。

      表3 百合燙片樣品含量測定(n=3) /mg·g-1

      表4 百合干燥樣品含量測定(n=3) /mg·g-1

      3 討論

      3.1 測定方法學(xué)考察

      對(duì)實(shí)驗(yàn)中各種檢測方法均進(jìn)行線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率考察,結(jié)果表明各指標(biāo)均符合含量測定要求,適于檢測相應(yīng)成分。

      3.2 燙片過程對(duì)百合質(zhì)量的影響

      煮制及蒸制樣品中酚性甘油酯含量與鮮品相比幾無變化,表明百合中酚性甘油酯在燙片過程得到很好保留。但燙片過程中多糖、核苷及氨基酸含量與鮮品相比均有不同程度的減少,表明水溶性成分在燙制過程中會(huì)有一定的損失,且損耗量隨燙制時(shí)間加長而增加。煮5~8 min和蒸8~10 min的樣品不僅外觀色澤較佳,而且各成分的含量較高。因煮制操作方便易行,認(rèn)為煮制5~8 min為較好的燙片工藝。

      3.3 干燥過程對(duì)百合質(zhì)量的影響

      根據(jù)燙片工藝的優(yōu)化結(jié)果,選擇煮8 min的樣品作為干燥工藝優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。比較新鮮樣品直接干燥與燙制樣品干燥后外觀,結(jié)果顯示煮制品干燥后外觀色澤較佳,而鮮品干燥的樣品外觀色澤較差,灰暗至深褐色,易出現(xiàn)焦糊狀;燙片樣品經(jīng)干燥其酚性甘油酯類成分含量均略高于鮮品直接干燥。原因是未經(jīng)燙片的鮮品在干燥過程中會(huì)發(fā)生酶促褐變,導(dǎo)致色澤的改變和營養(yǎng)成分的損失[12],其酚性甘油酯類成分含量減少可能是因?yàn)樾迈r百合中含有破壞酚羥基的多酚氧化酶,也可能是存在破壞酯基的羧酸酯酶,燙片過程則經(jīng)過短時(shí)間高溫起到抑制百合內(nèi)活性酶的作用,而阻止一系列生化反應(yīng)[13-14],鮮品冷凍干燥樣品在外觀和酚性甘油酯類成分含量與經(jīng)燙片干燥樣品基本相近,表明冷凍干燥在較低的溫度下,也可使酶活性降低。因此,燙片是百合干加工過程中必不可少的環(huán)節(jié)。干燥溫度也會(huì)影響百合的質(zhì)量,溫度過高或過低都會(huì)使其質(zhì)量降低,溫度控制在60~80 ℃適宜。

      3.4 適宜的百合干生產(chǎn)工藝

      根據(jù)研究結(jié)果,確定燙片和干燥過程工藝參數(shù)為:煮5~8 min,60~80 ℃烘干或冷凍干燥。但冷凍干燥法能耗高、生產(chǎn)成本大,產(chǎn)地加工時(shí)應(yīng)酌情考慮。

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      StudyontheEffectofDifferentProcessingMethodsinLiliumlancifoliumThunb.Bulbs

      NIE Hui1, 2*, YAN Hui2, QIAN Da-wei2*, DUAN Jin-ao2, OUyang Zhen1, QIAN Ye-fei2, GUAN Han-liang2

      (1.SchoolofPharmacy,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China;2.JiangsuKeyLaboratoryforHighTechnologyResearchofTraditionalChineseMedicineFormulae,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing, 210046,China)

      The purpose of this paper is to give support to establishing a standard processing method forLiliumlancifoliumThunb. bulbs, by comparing the changes on chemical compositions via different processes. Steam and boiling water was used in processing fresh bulbs. And 4 kinds of drying methods were used to deal with the boiled samples, including heated air drying, microwave drying, far infrared drying and freeze drying. Ultra-high performance liquid chromatography along with a diode array detector (UPLC-DAD) was used for analyzing phenylpropenoid glycosides, ultra-high performance liquid chromatography combined with a triple quadrupole electrospray tandem mass spectrometry (UPLC-TQ/MS) was applied for measuring nucleosides and amino acids, UV spectrophotometry (UV) was used for determining polysaccharide, respectively. It was in good appearance and higher contents that the samples were steamed 8~10 min or boiled 5~8 min, heated air dried at 60~80 ℃ and freeze dried. It was concluded that the boiling process was absolutely necessary for the primary processing. With considering various factors, the optimal conditions were obtained as following: the boiling time was 5~8 minutes, and the drying method was heated air drying at 60~80 ℃ or freeze drying.

      LiliumlancifoliumThunb.; Boiling processing; Drying methods; Technological optimization

      2013-01-10)

      國家中醫(yī)藥管理局行業(yè)科研專項(xiàng)(201107009)

      *

      錢大瑋,Tel:(025)85811916,E-mail:qiandwnj@126.com

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