涂秀文，尹海波*，安曄，陳靜，姚佳，王洪成

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.中國人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 藥劑科，遼寧 沈陽 110002)

中藥農(nóng)業(yè)

穿龍薯蕷種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法研究△

涂秀文1，尹海波1*，安曄2，陳靜1，姚佳1，王洪成1

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.中國人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 藥劑科，遼寧 沈陽 110002)

目的：研究穿龍薯蕷種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法，為穿龍薯蕷種子檢驗(yàn)規(guī)程和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。方法：參考國際植物種子檢驗(yàn)規(guī)程和農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程的方法對(duì)不同產(chǎn)地穿龍薯蕷種子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。穿龍薯蕷種子凈度分析送檢樣本最少500 g，試驗(yàn)樣本最少50 g；真實(shí)性檢驗(yàn)采用種子外觀形態(tài)比較；質(zhì)量測(cè)定采用百粒重；含水量測(cè)定采用高溫烘干法3 h；發(fā)芽前處理采用5 ℃低溫層積20 d，然后用100 mg·L-1的GA3溶液浸種30 h方法，種子發(fā)芽采用20 ℃恒溫砂石培養(yǎng)床萌發(fā)；生活力采用TTC染色法，染色溫度為45 ℃，TTC濃度為0.6%，染色時(shí)間為4 h。結(jié)果：穿龍薯蕷種子生活力和種子發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)，發(fā)芽率Y對(duì)生活力X回歸方程為Y=-10.591+1.058X。結(jié)論：初步建立了穿龍薯蕷種子扦樣，凈度分析，真實(shí)性鑒定，質(zhì)量，含水量，發(fā)芽及生活力7項(xiàng)指標(biāo)的檢驗(yàn)方法。

穿龍薯蕷；種子；質(zhì)量檢驗(yàn)方法；生活力；發(fā)芽率；相關(guān)性

穿龍薯蕷DioscoreanipponicaMakino為薯蕷科多年生草本植物，干燥根莖入藥，藥材習(xí)稱穿山龍[1]，為東北地區(qū)常用道地中藥，有祛風(fēng)除濕，舒筋通絡(luò)，活血止痛，止咳平喘等功效；用于風(fēng)濕弊病，關(guān)節(jié)腫脹，疼痛麻木，跌撲損傷，閃腰岔氣，咳嗽氣喘等證。現(xiàn)代研究證明穿龍薯蕷有調(diào)節(jié)免疫、改善心血管功能、鎮(zhèn)咳 祛痰、平喘等藥理作用，在臨床上治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、冠心病、心絞痛、慢性氣管炎、慢性布魯苗病、脂肪瘤等療效較好。

目前穿龍薯蕷在我國北部有大面積栽培，人工栽培主要通過種子繁殖，而種子基本來自于野生，種源混雜，因而種子質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響著藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量，亟待規(guī)范市場(chǎng)流通用種質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)對(duì)反映穿龍薯蕷種子質(zhì)量主要指標(biāo)的檢驗(yàn)方法進(jìn)行了研究，以期為穿龍薯蕷種子檢驗(yàn)規(guī)程和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

實(shí)驗(yàn)所用穿龍薯蕷種子為2012年8～9月采自黑龍江伊春，吉林集安，遼寧撫順3個(gè)產(chǎn)區(qū)的栽培居群和遼寧千山的野生居群，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)尹海波教授鑒定為穿龍薯蕷DioscoreanipponicaMakino的種子。

2 方法

2.1 扦樣

根據(jù)穿龍薯蕷種子的市場(chǎng)流通情況和單次可能的交易量，及凈度分析試驗(yàn)樣品不少于2500粒種子，而送檢樣品的質(zhì)量應(yīng)超過凈度分析量的10倍量的原則，確定穿龍薯蕷種子批的最大和樣品的最小質(zhì)量。按農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程(GB/T3543-1995)扦樣方法扦取送檢樣品和試驗(yàn)樣品[2-4]。

2.2 種子凈度分析

按農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程(GB/T3543-1995)凈度分析執(zhí)行。分別選取各產(chǎn)地種子50 g，進(jìn)行凈種子和雜質(zhì)的質(zhì)量測(cè)定，重復(fù)三次。

2.3 真實(shí)性鑒定

采用種子外觀形態(tài)法，隨機(jī)選取100粒凈種子，4次重復(fù)，逐粒用顯微鏡和游標(biāo)卡尺等相關(guān)儀器進(jìn)行外觀形態(tài)觀察，并記錄其結(jié)果。

2.4 質(zhì)量測(cè)定

分別采用百粒法和千粒法測(cè)定每份種子樣品質(zhì)量。(1)百粒法：隨機(jī)從凈種子中數(shù)取100粒，重復(fù)8次，計(jì)算平均質(zhì)量，標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。要求重復(fù)間變異系數(shù)小于4.0，測(cè)定值有效。(2)千粒法：隨機(jī)從凈種子數(shù)取1000粒，重復(fù)2次，計(jì)算平均質(zhì)量，標(biāo)準(zhǔn)差及兩重復(fù)間差數(shù)。要求2個(gè)重復(fù)間差數(shù)與平均數(shù)之比小于5%，測(cè)定值有效。

2.5 含水量測(cè)定

分別采用高恒溫烘干法和低恒溫烘干法測(cè)定每份種子樣品含水量。(1)低恒溫烘干法：在105 ℃條件下烘18 h后，計(jì)算種子含水量。(2)高恒溫烘干法：在130 ℃高溫條件下，分別烘1，2，3，4 h后計(jì)算種子含水量。每份稱種子樣品5 g，3次重復(fù)，要求每份樣品2次測(cè)定之間差距不超過0.2%。

2.6 發(fā)芽率測(cè)定

2.6.1 發(fā)芽前處理 種子先用0.3%的高錳酸鉀溶液浸泡10 min消毒，再用無菌水沖洗三遍，然后用以下方法進(jìn)行發(fā)芽前處理：(a)種子未經(jīng)任何處理，直接進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)；(b)種子采用5 ℃低溫層積15 d后進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)；(c)種子采用5 ℃低溫層積20 d后進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)；(d)種子采用5 ℃低溫層積15 d后，再用100 mg·L-1GA3浸種30 h后進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)[5-7]；(e)種子采用5 ℃低溫層積20 d后，再用100 mg·L-1GA3浸種30 h后進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)；(f)種子直接用100 mg·L-1GA3浸種30 h后直接著床。以上種子以雙層濾紙上做發(fā)芽床，在恒溫20 ℃，濕度65%，無光照的培養(yǎng)箱中，進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)。每次100粒種子，3次重復(fù)。

2.6.2 發(fā)芽床的選擇 試驗(yàn)樣本經(jīng)低溫層積20 d后，再用100 mg·L-1GA3浸種30 h后，選取濾紙，紗布，海綿，砂土4種發(fā)芽床試驗(yàn)。將種子分別置于不同發(fā)芽床，在20℃恒溫，濕度65%，無光照條件下的人工氣候箱中發(fā)芽。每次100粒種子，重復(fù)三次。

2.6.3 發(fā)芽溫度的選擇 試驗(yàn)樣本經(jīng)低溫層積20 d后，再用100 mg·L-1GA3浸種30 h后，分別置于15 ℃、20 ℃、25 ℃恒溫和15～25℃變溫，濕度65%，無光照的人工氣候培養(yǎng)箱中發(fā)芽。每次處理100粒種子，3次重復(fù)。

2.6.4 發(fā)芽首次和末次計(jì)數(shù)時(shí)間 確定初次和末次發(fā)芽時(shí)間，記錄下來。以胚根突出種皮長(zhǎng)度超過種子直徑一半時(shí)的天數(shù)作為初次計(jì)數(shù)時(shí)間。以種子萌發(fā)數(shù)達(dá)到最高，以后再無萌發(fā)種子出現(xiàn)時(shí)的天數(shù)作為末次計(jì)數(shù)時(shí)間。

2.6.5 發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的測(cè)定 種子著床后在設(shè)定的條件下發(fā)出的芽到達(dá)種子長(zhǎng)度的1/2時(shí)以此為標(biāo)準(zhǔn)判為發(fā)芽，種子發(fā)芽數(shù)與種子總數(shù)之比為發(fā)芽率。種子著床到16天時(shí)當(dāng)天發(fā)芽的種子數(shù)達(dá)到最高峰，因此種子著床16天時(shí)為記錄發(fā)芽勢(shì)的時(shí)間。

2.7 生活力測(cè)定

TTC染色法為目前國際上公認(rèn)的測(cè)定種子生活力較好方法[8]。將供試種子用清水預(yù)濕4 h，然后沿種脊將種子切成兩瓣。使其露出胚乳，一半放入培養(yǎng)皿，切面向下，滴入TTC溶液浸沒剖面，分別置于恒溫箱中，避光條件下染色，觀察并記錄染色情況。每次處理100粒，3次重復(fù)，正交方法確定最優(yōu)的種子染色方法。

2.8 種子生活力和種子發(fā)芽率相關(guān)性分析

發(fā)芽實(shí)驗(yàn)和生活力檢驗(yàn)是種子質(zhì)量檢驗(yàn)的重要項(xiàng)目[9]，本研究擬通過探討不同發(fā)芽條件用SPSS軟件分析種子活力與種子發(fā)芽率之間的相互關(guān)系。

3 結(jié)果與分析

3.1 扦樣

種子批的最大質(zhì)量為2 000 kg，送驗(yàn)品最少為500 g，凈度分析試樣最少為50 g。

3.2 凈度分析

4個(gè)產(chǎn)地的穿龍薯蕷種子凈度測(cè)定結(jié)果見表1。產(chǎn)地A為吉林集安，產(chǎn)地B為遼寧撫順，產(chǎn)地C為黑龍江伊春，產(chǎn)地D為遼寧鞍山。種子凈度較高，達(dá)90%以上。使用此方法作凈度分析，各試樣增失差距均沒有偏離原始質(zhì)量的5%，此方法切實(shí)可行。

表1 不同產(chǎn)地穿龍薯蕷種子凈度的測(cè)定

3.3 真實(shí)性鑒定

穿龍薯蕷種子四周有不等的薄膜狀翅，全體略呈橢圓狀腎形或長(zhǎng)橢圓形，長(zhǎng)8.9～14.1 mm，寬5.5～7.1 mm，厚0.5～0.9 mm，長(zhǎng)約比寬大2倍[10]。種仁為橢圓行，呈深棕色，腹側(cè)腎形凹入處下緣具點(diǎn)狀種臍，由腫臍向一側(cè)面伸出一棕色橫線狀種脊，膜質(zhì)，深棕色至無色透明。胚白色，細(xì)小，胚芽明顯，具子葉一枚，類似圓形，種子百粒重為0.5～1.3 g之間，千粒重為6.0～13.0 g之間。

3.4 質(zhì)量測(cè)定

采用百粒重法和千粒法測(cè)定4個(gè)產(chǎn)地種子試樣結(jié)果見表2。通過方差分析，采用2種方法測(cè)定4份種子試樣的千粒重，各處理間無顯著差異(P<0.05)，且數(shù)據(jù)重復(fù)間變異系數(shù)(或差數(shù)和平均數(shù)之比)均小于4.0，測(cè)定值有效，鑒于百粒法所需種子量較少，因此選用百粒重法。

表2 穿龍薯蕷種子不同質(zhì)量測(cè)定方法比較

3.5 含水量測(cè)定

采用高恒溫烘干法1，2，3，4 h對(duì)4個(gè)產(chǎn)地種子試樣的含水量測(cè)定結(jié)果如圖1。每產(chǎn)地取種子15 g，重復(fù)3次。采取高恒溫烘干法，穿龍薯蕷種子在最初的2 h內(nèi)迅速失去水分，隨后失水緩慢，烘干3，4 h時(shí)，測(cè)得種子的含水量值趨于穩(wěn)定，故選擇適宜烘干時(shí)間為3 h。

圖1 不同高溫烘干時(shí)間下穿龍薯蕷種子的失水后質(zhì)量

表3 穿龍薯蕷種子不同干燥方法的比較

本試驗(yàn)又對(duì)高恒溫烘干3 h和低恒溫烘干不同時(shí)間段測(cè)定的含水量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，高恒溫烘干3 h和低恒溫烘干17 h種子試樣的含水量值無顯著性差異，鑒于低溫烘干法需要時(shí)間長(zhǎng)，推薦使用高溫干燥法烘干3 h。

3.6 發(fā)芽的測(cè)定

3.6.1 發(fā)芽前處理 為使試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確，試驗(yàn)采用吉林通化種子發(fā)芽前處理試驗(yàn)。結(jié)果見圖2及表4，結(jié)果顯示低溫層積20 d+GA3浸種30 h處理方法用時(shí)最少，發(fā)芽勢(shì)最齊，發(fā)芽率最高，為最佳前處理方法。

表4 不同前處理方法對(duì)穿龍薯蕷種子發(fā)芽情況影響的比較

圖2 穿龍薯蕷種子不同前處理方法比較

3.6.2 發(fā)芽床和發(fā)芽溫度的選擇 四個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的穿龍薯蕷種子均已通過低溫層積20d+GA3浸種30 h處理，四產(chǎn)區(qū)種子選用不同發(fā)芽床，不同溫度時(shí)的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)如表5。由下表可見穿龍薯蕷種子在砂土培養(yǎng)床上的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均為最好，其次是海綿發(fā)芽床，再次是濾紙培養(yǎng)床，最不好的是紗布培養(yǎng)床。穿龍薯蕷種子在溫度20℃時(shí)為最佳發(fā)芽溫度。故確定穿龍薯蕷種子發(fā)芽最佳條件為20℃時(shí)砂土培養(yǎng)床培養(yǎng)。

3.7生活力的測(cè)定

TTC濃度和染色時(shí)間分別進(jìn)行單因素篩選試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選取每個(gè)因素中的3個(gè)水平，采用L9(33)表安排正交試驗(yàn)，見表6及表7，以種胚的染色率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。每次處理100粒種子，重復(fù)3次[11]。

表5 不同產(chǎn)區(qū)穿龍薯蕷種子發(fā)芽床和溫度的選擇

表6 L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 正交試驗(yàn)方差分析

由以上L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果表可以看出影響因素的影響大小排序?yàn)锽>A>C，由數(shù)據(jù)可知TTC濃度為最顯著影響因素，其最佳染色條件為A2B2C3，即染色溫度為45 ℃，TTC濃度為0.6%，染色時(shí)間為4.0 h時(shí)染色率最高，染色最快。根據(jù)正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果顯示TTC濃度的P<0.05，結(jié)果有意義。

3.8 種子生活力和種子發(fā)芽率相關(guān)性分析

選取溫度為45℃，TTC濃度為0.6%，染色時(shí)間為4.0 h為染色條件來測(cè)定四個(gè)產(chǎn)地穿龍薯蕷種子的種子活力。選取20℃時(shí)砂土培養(yǎng)床培養(yǎng)為種子發(fā)芽條件。試驗(yàn)結(jié)果見表8。

表8 穿龍薯蕷種子生活力和種子發(fā)芽率

將TTC測(cè)定生活力的結(jié)果分別與相對(duì)應(yīng)測(cè)定種子發(fā)芽率得到的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性測(cè)驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)r為0.994，P=0.006<0.05，具有顯著性差異。表明TTC測(cè)定生活力得出的生活力值和種子發(fā)芽率有顯著相關(guān)性，通過測(cè)定種子生活力也可以快速判定發(fā)芽[12]。進(jìn)一步計(jì)算得發(fā)芽率Y對(duì)生活力X回歸系數(shù)為b=1.058，回歸方程為Y=-10.591+1.058X。

4 結(jié)論與討論

農(nóng)作物種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法比較成熟，而大部分中藥材種子還沒有相應(yīng)的國家檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，無法對(duì)市場(chǎng)上的中藥材種子質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn)和有效控制。因此，開展藥用植物種子標(biāo)準(zhǔn)研究是我國中藥材規(guī)范化生產(chǎn)急需解決的重要問題[13-14]。本試驗(yàn)從穿龍薯蕷種子扦樣，凈度分析，真實(shí)性鑒定，質(zhì)量，含水量，發(fā)芽及生活力7方面對(duì)穿龍薯蕷種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法進(jìn)行了研究。確定了適宜穿龍薯蕷種子質(zhì)量指標(biāo)的檢驗(yàn)方法。

不同產(chǎn)地穿龍薯蕷種子的生物學(xué)特性有一定差異，在建立種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法時(shí)需考慮種子材料的代表性。本試驗(yàn)所用種子取自4個(gè)地區(qū)，能較好的代表生產(chǎn)上穿龍薯蕷藥用用種子質(zhì)量。

由種子生活力和種子發(fā)芽率相關(guān)性分析試驗(yàn)可知，TTC染色法測(cè)定的穿龍薯蕷種子生活力與發(fā)芽率存在極大的相關(guān)性。在生產(chǎn)和貿(mào)易過程中，運(yùn)用生活力(X)與發(fā)芽率(Y)的回歸方程Y=-10.591+1.058X，可以通過快速測(cè)定種子生活力，來預(yù)測(cè)穿龍薯蕷種子發(fā)芽率，在理論和實(shí)踐上都有重要的作用[15]。

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TestingMethodsforSeedQualityofDioscoreanipponica

TU Xiu-wen1，YIN Hai-bo1，AN Ye2，CHEN Jing1，YAO Jia1，WANG Hong-cheng1*

(1.LiaoNingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China; 2.PharmacyDepartment，People'sLiberationArmyGeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion，Shenyang110002，China)

Objective：To study the quality inspection method of the seed ofDioscoreanipponicaMakino，provide the basis for the development of testing procedures and quality standards.Methods：Refer to the international seed testing rules and the method of crop seed inspection procedures，test different regions seed quality content.Results：The submitted samples ofD.nipponicaseed is at least 500 g for purity analysis，and test samples at least 50 g；authenticity identification of seed by appearance shape comparison；quality determination by the hundred seed；water content determination by high temperature drying method for 3 h；before germination by 5 ℃ low temperature stratification about 20 d，and then use the method of 30 h 100 mg·L-1GA3 solution soaking，germination by 20 ℃ sand culture bed germination；TTC staining method was used for seed viability test，the dyeing temperature was 45 ℃，TTC concentration was 0.6%，dyeing time was 4 h.Seed germination rate(Y)was significantly correlated with seed viability(X)，and the regression equation wasY=-10.591+1.058X.Conclusion：The 7 indicators test method ofD.nipponicaseed have been preliminary established.7 indicators are：sampling，purity analysis，authenticity identification，quality，water content，germination rate and seed viability.

DioscoreanipponicaMakino；Seed；Quality testing methods；Vitality；Germination rate；Correlation

2013-04-11)

遼寧省教育廳項(xiàng)目(2009A498)；杏林青藍(lán)工程杰出人才基金

*

尹海波教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥資源及藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)，E-mail：yhb0528@sina.com