綠色熒光蛋白基因標記棉花黃萎病菌

徐 明， 桂月晶， 祁偉彥， 柳少燕， 陳捷胤， 戴小楓

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

大麗輪枝菌（VerticilliumdahliaeKleb.）是引起棉花黃萎病的主要病原菌，可導致棉花葉片變黃萎蔫甚至枯死，給棉花生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。我國棉花黃萎病尤為嚴重，已經(jīng)成為棉花生產(chǎn)上第一大病害，尤其是1993、1995、1996和2003年的大暴發(fā)，導致棉田損失慘重，嚴重的田塊甚至絕收［1－3］。它同時還危害番茄、茄子、辣椒、黃瓜、萵苣等200多種主要經(jīng)濟作物，是典型的土傳性維管束真菌病害［4－5］。大麗輪枝菌是一種絲狀真菌，分類學上屬于子囊菌門（Ascomycota）、糞殼菌綱（Sordariomyce－tes）、黑痣菌目（Phyllachorales）、叢梗孢科（Moniliaceae）、輪枝菌屬（Verticillium）［4］。野生型大麗輪枝菌在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀為圓形菌落，產(chǎn)生白色菌絲、大量黑色微菌核的黑色菌落或者介于兩者之間的中間形態(tài)，培養(yǎng)型和菌株的致病力無顯著關(guān)聯(lián)［6－7］。

綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）大量應(yīng)用于多種細菌、真菌、植物和哺乳動物細胞的研究［8］，其表達不需要任何外源底物或輔助因子，對細胞的正常生長和功能等沒有毒性，在熒光顯微鏡或紫外光下能直接檢測到綠色熒光，具有快速、方便、動態(tài)監(jiān)測、定量分析等優(yōu)點［8］。綠色熒光蛋白在植物病理學中有著廣泛應(yīng)用，包括抗病基因亞細胞定位、啟動子活性分析、基因表達分析、病原菌與植物互作研究等，尤其是用于跟蹤病原菌侵染寄主途徑的研究，可直觀、實時監(jiān)測病原菌的發(fā)生、定殖和侵染過程［9－10］。如利用GFP標記的煙草疫霉（Phytophthoraparasiticavar.nicotianae）研究其侵染煙草過程中的生長動態(tài)和與寄主互作方式［11］；應(yīng)用GFP基因標記大麗輪枝菌研究其在萵苣整個生長期侵染的情況［12］；利用GFP標記馬鈴薯細菌性軟腐病菌（Dickeyasp.）研究其侵染情況和在整個植株中的動態(tài)變化情況［13］；觀察尖孢炭疽菌（Colletotrichumacutatum）侵染草莓的規(guī)律［14］；跟蹤香蕉黑條葉斑病菌（Mycosphaerellafijiensis）、香蕉黃條葉斑病菌（M.musicola）和斑枯病菌（M.eumusae）在葉片組織中的生長動態(tài)以及隨著菌絲侵入引起葉片逐漸褪綠和壞死過程［15］；檢測大豆疫霉對大豆葉片、下胚軸和根部的侵染行為［16］。在大麗輪枝菌研究方面，已經(jīng)成功構(gòu)建綠色熒光蛋白基因的大麗輪枝菌，并對萵苣、馬鈴薯、花椰菜、菠菜等寄主的侵染過程進行了研究［17－20］。因此，GFP標記已經(jīng)成為研究病原菌與植物互作的有力工具，避免了傳統(tǒng)組織印跡法、放射性標記核酸探針法、GUS染色法等非活體檢測的局限性，極大地推動了病原菌致病機理的研究。

本研究的主要工作是將克隆的熒光蛋白基因sGFP連接到pCTHyg上，構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白標記的載體p CH－sGFP；通過農(nóng)桿菌介導的大麗輪枝菌遺傳轉(zhuǎn)化和篩選，獲得帶有熒光蛋白表達的大麗輪枝菌轉(zhuǎn)化株；進一步通過表型鑒定和對棉花的致病力檢測，篩選到綠色熒光蛋白表達穩(wěn)定、發(fā)光強、表型和致病力與野生型類似的sGFP標記大麗輪枝菌，為下一步觀察大麗輪枝菌侵染棉花過程的組織學和致病機理研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試棉種為高感黃萎病‘軍棉1號’（Gossypiumhirsutum‘Junmian 1’）。棉花高致病性大麗輪枝菌Vd991為中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所簡桂良研究員饋贈，根癌農(nóng)桿菌AGL－1由本實驗室保存。攜帶有綠色熒光蛋白基因sGFP的質(zhì)粒gGFP購自美國真菌遺傳學信息中心（Fungal Genetics Stock Center，American），質(zhì)粒pCTHyg為本試驗室構(gòu)建。

1.2 綠色熒光蛋白表達載體構(gòu)建

根據(jù)質(zhì)粒gGFP序列信息設(shè)計帶有HindⅢ和XbaⅠ酶 切 位 點 的 引 物 （gGFP－F：AAGCTTCTTTCGACACTGAAATACGTCG；gGFP－R：TCTAGAGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAG），以質(zhì)粒gGFP為模板，擴增獲得帶有構(gòu)巢曲霉GPD啟動子和Nos終止子的綠色熒光蛋白標記基因sGFP（擴增條件：94℃10 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃3.5 min，循環(huán)36次；72℃10 min），隨后利用HindⅢ和XbaⅠ酶切位點將GPD－sGFP－Nos片段整合到p CTHyg載體，獲得重組載體pCH－sGFP。

1.3 大麗輪枝菌遺傳轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌介導的大麗輪枝菌遺傳轉(zhuǎn)化參照Mullins等的方法進行［21］。將pCH－sGFP載體導入農(nóng)桿菌AGL－1，挑取克隆接種于 MM 培養(yǎng)基［22］，28℃振蕩培養(yǎng)48 h，離心收集菌體并用IM液體培養(yǎng)基［23］重懸并稀釋至A600≈0.15，加入乙酰丁香酮至200μmol／L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至A600≈0.5。大麗輪枝菌接種于CM 液體培養(yǎng)基［24］，25 ℃，150 r／min振蕩培養(yǎng)4 d后稀釋孢子懸浮液濃度至5×106個／m L。等比例混合制備好的農(nóng)桿菌和孢子懸浮液后，吸取200μL混合菌液涂布于含有200μmol／L乙酰丁香酮的IM固體培養(yǎng)基，支撐膜為微孔濾膜。25℃培養(yǎng)48 h后將微孔濾膜轉(zhuǎn)移至含有200μg／m L頭孢霉素和30μg／mL潮霉素的PDA培養(yǎng)基（去皮馬鈴薯，200 g／L；葡萄糖，20 g／L；瓊脂，15 g／L），繼續(xù)培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)化子菌落出現(xiàn)。

1.4 綠色熒光蛋白標記的大麗輪枝菌的篩選

挑取轉(zhuǎn)化子于無菌水中，在含有抗性的培養(yǎng)基中單孢分離3代。選取9個轉(zhuǎn)化子進行分子鑒定?；蚪M提取采用天根公司的DNA提取試劑盒（DP320－02），根據(jù)sGFP基因設(shè)計引物（sGFP－F：ATGGTGAGCAAGGGCGAGG；sGFP－R：TTCTGCTGGTAGTGGTCGGC）并進行PCR擴增（擴增條件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃1 min，循環(huán)30次；72℃10 min），篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

1.5 綠色熒光蛋白標記的大麗輪枝菌的熒光檢測和表型鑒定

用無菌牙簽刮取少量菌絲于載玻片上的無菌水中，置于激光共聚焦掃描顯微鏡（Leica TCS SP2，Germany）下進行熒光檢測，激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射波長為540 nm，野生型Vd991為對照。

選取熒光信號較強的4個轉(zhuǎn)化子，以野生型菌株Vd991為對照，吸取20μL孢子懸浮液（5×106個／m L）涂布于含有30μg／m L潮霉素的PDA平板中，置于25℃ 恒溫培養(yǎng)12 d，觀察轉(zhuǎn)化子生長表型；吸取5μL的大麗輪枝菌孢子懸浮液對感病棉種‘軍棉1號’進行穿刺接種，參照Alcazar等方法進行［25］，穿刺15株，3個重復，接菌后的第2、3、4、5和6周調(diào)查病情。分級標準為：0級—健株，子葉、真葉無病狀；1級—1片子葉發(fā)??；2級—2片真葉發(fā)??；3級—3片及3片以上真葉發(fā)病；4級—棉苗所有葉片發(fā)病，生長點枯死。病情指數(shù)＝100×∑（各級病葉數(shù)×各級代表值）／（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級代表值）。篩選表型、致病力均與野生型Vd991一致的sGFP標記轉(zhuǎn)化子。

1.6 綠色熒光蛋白標記大麗輪枝菌侵染棉花的發(fā)光檢測

感病棉種‘軍棉1號’種子于5%NaCl O溶液中處理20 min，無菌水清洗后轉(zhuǎn)移到盛有適量無菌水的三角瓶，25℃浸泡萌發(fā)。萌發(fā)后的種子種植于經(jīng)高壓滅菌2 h的蛭石中繼續(xù)培養(yǎng)（光周期14 h，白天25℃，晚上21℃，相對濕度85%），直至子葉平展。

制備帶有綠色熒光蛋白基因標記的大麗輪枝菌的孢子懸浮液（5×106個／m L），幼苗根系用無菌水沖洗后置于孢子懸浮液中浸泡2 min，隨后轉(zhuǎn)移到新滅菌的蛭石中繼續(xù)培養(yǎng)，接菌14 d后取樣。用無菌刀片對棉苗莖部組織進行徒手切片，厚度約100μm。借助激光共聚焦掃描顯微鏡觀察大麗輪枝菌侵染過程綠色熒光蛋白的發(fā)光情況，激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長分別為540 nm和560～670 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠色熒光蛋白基因的重組載體構(gòu)建

以gGFP為模板，利用引物gGFP－F／R進行PCR擴增獲得 GPD－sGFP－Nos片段，約3.3 kb（圖1a）。經(jīng)HindⅢ和XbaⅠ雙酶切連接到pCTHyg載體上，酶切驗證獲得攜帶有GPD－sGFP－Nos基因元件的重組載體pCH－sGFP（圖1b）。重組載體pCH－sGFP中增強型綠色熒光蛋白基因sGFP以構(gòu)巢曲霉GPD為啟動子，抗性篩選標記基因Hyg以TrpC為啟動子，2個基因均以Nos為終止子（圖2）。

2.2 綠色熒光蛋白基因的整合與轉(zhuǎn)化子篩選

重組載體pCH－sGFP導入到農(nóng)桿菌AGL－1，并通過遺傳轉(zhuǎn)化后獲得大麗輪枝菌轉(zhuǎn)化子208個（圖3a、b）。隨機選取9個轉(zhuǎn)化子進行單孢分離，對第3代的轉(zhuǎn)化子進行了PCR驗證。結(jié)果表明，所挑選的9個轉(zhuǎn)化子的sGFP均成功整合到大麗輪枝菌基因組中（圖3c），獲得了綠色熒光蛋白標記的大麗輪枝菌。

2.3 綠色熒光蛋白標記大麗輪枝菌的熒光檢測

對9個已經(jīng)整合sGFP的大麗輪枝菌轉(zhuǎn)化子進行熒光檢測發(fā)現(xiàn)，Vd－gfp19、Vd－gfp77、Vd－gfp80和Vd－gfp107無論是處于孢子階段還是菌絲階段均能表達綠色熒光蛋白，其中Vd－gfp77最為顯著，孢子和菌絲均能發(fā)出強烈的熒光信號（圖4a、b、c、d）。在無潮霉素抗性選擇壓力下連續(xù)繼代（5代）的大麗輪枝菌Vd－gfp19、Vd－gfp77、Vd－gfp80和 Vd－gfp107，轉(zhuǎn)接后均能在含有潮霉素抗性的培養(yǎng)基正常生長，且均能產(chǎn)生綠色熒光信號，其中Vd－gfp77的熒光信號表現(xiàn)較為穩(wěn)定和均一（圖4e）。

圖3 重組載體pCH－sGFP的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子驗證Fig.3 Transformation of the recombinant vector pCH－sGFP and transformants variation

2.4 綠色熒光蛋白標記大麗輪枝菌表型與致病力測定

對 Vd－gfp19、Vd－gfp77、Vd－gfp80 和 Vd－gfp107轉(zhuǎn)化子的表型進行檢測，綠色熒光蛋白標記的大麗輪枝菌在PDA培養(yǎng)基上的生長形態(tài)與野生型Vd991類似（圖5a），如 Vd－gfp19、Vd－gfp77和 Vdgfp107的形態(tài)均為圓形、白色、氣生菌絲發(fā)達且致密（圖5b、c和e）。但綠色熒光蛋白標記的大麗輪枝菌Vd－gfp80的表型則發(fā)生了顯著變化，在PDA培養(yǎng)基上表現(xiàn)為產(chǎn)生黑色素的特性（圖5d）。結(jié)合Vdgfp77綠色熒光的穩(wěn)定性和均一性以及生長表型的一致性，選擇其作為侵染過程研究的候選綠色熒光蛋白標記的大麗輪枝菌。

進一步對綠色熒光蛋白標記的大麗輪枝菌Vdgfp77的致病力進行鑒定，與野生型Vd991類似，侵染2周后感病棉種即開始發(fā)病，病情指數(shù)為37.77；此后，病情迅速擴展，各周調(diào)查的病情指數(shù)與野生型Vd991相似；侵染6周后，野生型Vd991侵染棉花的病情指數(shù)為78.33，Vd－gfp77侵染棉花的病情指數(shù)為78.78（圖6b），而且兩者均引起了棉花葉片萎蔫變黃和落葉的典型黃萎病癥狀（圖6c、d）。結(jié)果說明，sGFP整合到Vd991基因組對其自身的特性影響很小，Vd－gfp77是一株類似于野生型Vd991的高致病力綠色熒光蛋白標記的大麗輪枝菌。

圖6 綠色熒光蛋白標記大麗輪枝菌Vd－gfp77的致病力測定Fig.6 Virulence of the transformant Vd－gfp77 to cotton plants

2.5 綠色熒光蛋白標記的大麗輪枝菌Vd－gfp77侵染棉花過程的熒光檢測

為了檢測綠色熒光蛋白標記的大麗輪枝菌在活體侵染條件的穩(wěn)定性，對Vd－gfp77侵染感病棉花的組織學進行了初步研究。侵染14 d后，組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，大麗輪枝菌Vd－gfp77侵染棉花后可借助于激光共聚焦顯微鏡進行觀察，定殖與擴展的菌絲富集在根冠區(qū)（圖7a）和維管束（圖7b），而且可以明顯觀察到萌發(fā)的孢子（圖7c）。結(jié)果說明，高致病力綠色熒光蛋白標記的大麗輪枝菌Vd－gfp77類似于Vd991，可快速侵染棉花并在侵染過程中表達綠色熒光蛋白。至此，本研究成功構(gòu)建了適合用于侵染植物（棉花）過程組織學研究的綠色熒光蛋白標記的大麗輪枝菌。

圖7 Vd－gfp77侵染棉花過程的熒光檢測Fig.7 Detection of fluorescence in cotton plants inoculated with Vd－gfp77

3 討論

綠色熒光蛋白基因整合到大麗輪枝菌基因組中，由于插入位置效應(yīng)可能引起生長異?；蛘咧虏×适?，不適宜用于后續(xù)研究。本試驗采用了p CTHyg載體構(gòu)建了含有綠色熒光蛋白基因的載體pCH－sGFP（圖1、圖2），通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法成功導入到大麗輪枝菌并獲得了陽性轉(zhuǎn)化株（圖3），骨架載體采用了潮霉素作為篩選標記在大麗輪枝菌中已經(jīng)得到成功和廣泛應(yīng)用［26］。這為本試驗成功獲得大量的遺傳轉(zhuǎn)化子提供了保障，便于篩選獲得表型穩(wěn)定和致病力正常的菌株。

綠色熒光蛋白的熒光性質(zhì)具有穩(wěn)定、直觀、操作方便和無需添加外源底物即可直接檢測等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原菌與寄主植物互作的研究［8－10，16］。通過改造也衍生出了不同的增強型熒光蛋白，如將第65位絲氨酸突變成蘇氨酸，其熒光強度較野生型GFP強5倍［27］，在病原菌與植物互作研究過程中顯示了獨特的優(yōu)越性。在大麗輪枝菌研究方面，已有研究報道對從萵苣、馬鈴薯、花椰菜、菠菜等分離出的菌株進行了熒光標記并開展侵染過程研究［17－20］，但對危害嚴重的棉花的侵染研究鮮有報道，究其原因是棉花組織的木質(zhì)化程度較高，侵染過程中報告基因的熒光強度受到影響且穩(wěn)定性差，加上棉花根部的本底熒光較強，嚴重干擾了研究結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，如利用標記棉花大麗輪枝菌（落葉型的V07DF2和非落葉型的Bp2）接種寄主棉花上（‘泗棉3號’），由于本底熒光的影響，導致很多細節(jié)無法分辨［28］。本研究應(yīng)用改良的增強型綠色熒光蛋白sGFP具有熒光信號強、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點，篩選獲得的Vd－gfp77轉(zhuǎn)化株生長表型正常，致病力與野生型菌株相比無顯著差異，侵染寄主棉花后隨著大麗輪枝菌的繁殖傳代，仍能穩(wěn)定表達并發(fā)出強烈的熒光信號，受棉花組織本底熒光的影響小，易于檢測，可以滿足后續(xù)大麗輪枝菌侵染棉花的組織學過程研究。此外，本研究構(gòu)建的綠色熒光蛋白表達載體和菌株也可以應(yīng)用于基因的亞細胞定位、啟動子活性分析、基因表達分析、基因功能和寄主蛋白等研究。

本研究構(gòu)建了增強型綠色熒光蛋白重組質(zhì)粒pCH－sGFP，通過農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化法獲得了綠色熒光蛋白標記的大麗輪枝菌，篩選到一株具有強烈熒光信號的轉(zhuǎn)化株Vd－gfp77，其表型和對棉花的致病力與野生型Vd991類似，連續(xù)傳代后抗性篩選標記、熒光信號、表型和致病力均能夠穩(wěn)定遺傳，侵染棉花后綠色熒光蛋白表達穩(wěn)定，由此獲得了適合用于侵染植物（棉花）過程組織學研究的綠色熒光蛋白標記的大麗輪枝菌。

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