沈立姿，房立叢，于津鵬，胡遠(yuǎn)艷，朱曉鵬，高炳淼，羅素蘭，長(zhǎng)孫東亭

(海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南大學(xué)?？谑泻Ｑ笏幬镏攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?70228)

疼痛是實(shí)際的或潛在的組織損傷所引起的一種不愉快的感覺(jué)，也是一種預(yù)警機(jī)制，它可防止機(jī)體遭受壓迫或進(jìn)一步損傷.疼痛可分為生理性疼痛和病理性疼痛2種，而后者又可分為炎癥性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛.1994年，國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)［1］(International Association for the Study of Pain，IASP)將其定義為“一種與組織損傷或潛在的與損傷相關(guān)的不愉快的主觀感覺(jué)和情感體驗(yàn)”.

疼痛并不僅僅是一種單一的感覺(jué)，它有復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制［2－3］.雖然止痛藥可以緩解不同類型的疼痛，但它們的作用機(jī)理是千差萬(wàn)別的，尤其是神經(jīng)病理性疼痛，它的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，也頑固難愈.有研究表明，炎癥介質(zhì)在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮著重要的作用，神經(jīng)損傷后由于G蛋白偶聯(lián)受體的作用，神經(jīng)的敏感性也會(huì)增加.突觸后膜去極化可以抑制甘氨酸受體激活，從而產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏［4］.1988年BENNET等［5］成功建立了大鼠坐骨神經(jīng)慢性擠壓傷病理性痛模型(chronic constriction nerve injury model，CCI)，為神經(jīng)病理性疼痛的研究提供了動(dòng)物模型，并在臨床研究中得到廣泛的發(fā)展和應(yīng)用.有研究人員采用不同的實(shí)驗(yàn)材料對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)進(jìn)行結(jié)扎，以研究其對(duì)CCI模型的影響.但到目前為止，尚未看到結(jié)扎道數(shù)對(duì)大鼠CCI模型效果差異的相關(guān)報(bào)道.因此，筆者采用大鼠CCI模型研究了芋螺毒素對(duì)神經(jīng)性疼痛的鎮(zhèn)痛藥效，分別比較了絲線和鉻制羊腸線結(jié)扎坐骨神經(jīng)2，3，4道對(duì)疼痛閾值的影響，以期摸索出一種高效、簡(jiǎn)便的大鼠CCI建模方法.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 IITC Electronic von Frey Model 2390 Series(美國(guó)IITC公司);4－0號(hào)可吸收性外科縫線(山東博達(dá)醫(yī)療用品有限公司);3－0號(hào)非吸收性外科縫線(姜堰市新康絲線廠);Precisa電子天平(Xs 365M-sc);青霉素鈉(江西東風(fēng)藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):110911－2);戊巴比妥鈉(Sigma試劑公司，批號(hào)059H0612).

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量180～220 g.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明許可證號(hào):SCXK(粵)2008－0002.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將大鼠隨機(jī)分成7組，每組6只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，自由攝食和飲水.實(shí)驗(yàn)室溫度保持在23～25℃.實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉70 mg·kg－1麻醉，當(dāng)大鼠麻醉完全，痛覺(jué)消失后，置于超凈工作臺(tái)上進(jìn)行無(wú)菌手術(shù).手術(shù)區(qū)域剃毛，局部皮膚碘酊消毒，用φ=70%的乙醇脫碘，逐層切開(kāi)皮膚、筋膜，鈍性分離肌肉，使坐骨神經(jīng)主干暴露在視野內(nèi)，用鑷子將坐骨神經(jīng)主干輕輕剝離，在坐骨神經(jīng)干上每間隔約1 mm處用鉻制羊腸線和絲線分別做2，3，4道結(jié)扎.在結(jié)扎時(shí)保持力度一致，結(jié)扎強(qiáng)度以不阻斷神經(jīng)血管循環(huán)為宜(松緊適宜即可)，逐層縫合肌肉和皮膚，并在縫合前和縫合后的傷口處涂抹青霉素粉末以防術(shù)后感染，假手術(shù)組只暴露坐骨神經(jīng)主干，不進(jìn)行結(jié)扎，其余處理同神經(jīng)結(jié)扎組，大鼠右下肢不作任何處理，術(shù)后單籠飼養(yǎng)至傷口愈合，自由攝食及飲水.

1.4 機(jī)械性縮足反應(yīng)閾值MWT的測(cè)定 MWT測(cè)值時(shí)間在8:00～18:00之間完成，用Electronic von Frey機(jī)械測(cè)痛儀測(cè)定.將大鼠放置于有機(jī)玻璃觀察格中，它可以自由活動(dòng)，觀察格則放置在頂層具網(wǎng)眼的金屬架上，讓其適應(yīng)15 min，待探覓行為消失后，測(cè)痛儀從下向上透過(guò)網(wǎng)眼刺激大鼠左后足3次，每次間隔時(shí)間為10 min.取3次測(cè)量的平均值作為大鼠的痛閾值.術(shù)前測(cè)量大鼠左后肢的機(jī)械痛閾值，手術(shù)后7 d，14 d，21 d，用同種方法測(cè)量大鼠術(shù)后的痛閾值.

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 所獲實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS(Statistical Product and Service Solutions)13.0軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.各組術(shù)前、術(shù)后痛閾值用均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差表示(±s表示，以P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異)，用Origin軟件作圖.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)扎手術(shù)以及結(jié)扎道數(shù)對(duì)大鼠機(jī)械痛閾值MWT的影響 每組CCI大鼠在施行坐骨神經(jīng)結(jié)扎手術(shù)之前，測(cè)定其機(jī)械痛閾值MWT，這組數(shù)值即為基礎(chǔ)痛閾值(表1中的第1列).假手術(shù)組的基礎(chǔ)痛閾值即為暴露坐骨神經(jīng)主干操作前的MWT.施行手術(shù)后的第7天，分別測(cè)定7組大鼠的機(jī)械痛閾值，同時(shí)觀察每組大鼠是否存在自噬現(xiàn)象，其結(jié)果如表1所示.在所有大鼠實(shí)驗(yàn)組中，只有結(jié)扎絲線4道組出現(xiàn)了1只大鼠的自噬現(xiàn)象，其余大鼠均表現(xiàn)正常.只有假手術(shù)組在施行手術(shù)前后的機(jī)械痛閾值MWT沒(méi)有顯著變化，假手術(shù)組的基礎(chǔ)痛閾值平均為(33.9±3.0)g，暴露坐骨神經(jīng)主干手術(shù)后的痛閾值平均為(34.5±5.0)g，二者之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異.而其他施行了結(jié)扎手術(shù)的CCI組，在結(jié)扎前后的痛閾值普遍減小.其中，結(jié)扎絲線2道在結(jié)扎前后的MWT分別為(33.0±5.3)g和(27.4±3.7)g，結(jié)扎前后的MWT平均相差5.6 g，二者差異最小，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.而其余5個(gè)CCI組在結(jié)扎前后的痛閾值差異很顯著，作為神經(jīng)痛CCI模型都是成功的.結(jié)扎絲線3道組在結(jié)扎前后的MWT分別為(32.8±5.3)g和(24.1±4.0)g，二者平均相差8.7 g.結(jié)扎羊腸線4道組在結(jié)扎前后的MWT分別為(34.6±5.1)g和(19.9±3.3)g，二者平均相差14.7 g.其余3個(gè)CCI組，即結(jié)扎絲線4道組，結(jié)扎羊腸線2和3道組，在結(jié)扎前后的MWT之間的差異在8.7～14.7 g的范圍內(nèi)，這說(shuō)明結(jié)扎是CCI模型產(chǎn)生神經(jīng)痛的根本原因，手術(shù)的機(jī)械操作會(huì)自愈，不會(huì)對(duì)大鼠神經(jīng)痛產(chǎn)生質(zhì)的影響.絲線結(jié)扎的道數(shù)對(duì)神經(jīng)痛的發(fā)展有一定的影響，而在羊腸線組中，于2，3，4道組之間進(jìn)行組間比較時(shí)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，這意味著羊腸線結(jié)扎道數(shù)(2～4道)對(duì)大鼠疼痛閾值的影響不大，且沒(méi)有自噬現(xiàn)象出現(xiàn).綜上分析比較，坐骨神經(jīng)結(jié)扎2道具有手術(shù)易施、簡(jiǎn)便快速，且對(duì)坐骨神經(jīng)損傷最小等優(yōu)點(diǎn)，是首選的建模方法.

表1 大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎前后機(jī)械痛閾值的變化±s，g

表1 大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎前后機(jī)械痛閾值的變化±s，g

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，與自身基礎(chǔ)比較;#P ＜0.05，##P ＜0.01，與假手術(shù)組比較

痛閾值 自噬現(xiàn)象假手術(shù)組 33.9 ±3.0 34.5 ±5.0結(jié)扎方式 基礎(chǔ)痛閾值 結(jié)扎后7 d無(wú)結(jié)扎絲線2道 33.0±5.3 27.4±3.7 無(wú)結(jié)扎絲線3道 32.8±5.3 24.1±4.0＊＊## 無(wú)結(jié)扎絲線4 道 33.4 ±5.0 22.7 ±5.2＊＊## 1 只結(jié)扎羊腸線2道 34.8±4.5 21.2±3.3＊＊## 無(wú)結(jié)扎羊腸線3道 34.1±4.2 21.2±3.5＊＊## 無(wú)結(jié)扎羊腸線4 道 34.6 ±5.1 19.9 ±3.3＊＊##無(wú)

2.2 結(jié)扎手術(shù)后不同時(shí)間的機(jī)械痛閾值MWT的變化情況 在結(jié)扎手術(shù)后的第14天與第21天，分別測(cè)定各組的機(jī)械痛閾值，結(jié)果見(jiàn)表2，將基礎(chǔ)痛閾值和手術(shù)后第7天的痛閾值一起繪制曲線，結(jié)果如圖2所示.7個(gè)組的MWT在術(shù)后1周、2周和3周的測(cè)定值都沒(méi)有明顯的變化，神經(jīng)痛模型穩(wěn)定.例如，假手術(shù)組在術(shù)后的1，2，3周的MWT平均在33.8～35.2 g之間，幾乎沒(méi)有變化;建模成功的5個(gè)CCI組在術(shù)后的1，2，3周的MWT差異都不大，平均在0.9～1.8 g范圍內(nèi)，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，這說(shuō)明神經(jīng)痛在術(shù)后的第7天已產(chǎn)生，且持續(xù)很久，不會(huì)自愈.羊腸線組的神經(jīng)痛比絲線組略嚴(yán)重，羊腸線組對(duì)觸覺(jué)疼痛更加敏感，也沒(méi)有出現(xiàn)自噬現(xiàn)象，這可能與羊腸線組有神經(jīng)痛和炎性痛的雙重作用有關(guān).

表2 大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎后不同時(shí)間機(jī)械痛閾值的比較±s，g

表2 大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎后不同時(shí)間機(jī)械痛閾值的比較±s，g

21 d假手術(shù)組結(jié)扎方式 結(jié)扎后7 d 結(jié)扎后14 d 結(jié)扎后34.5 ±5.0 33.8 ±4.5 35.2 ±4.0結(jié)扎絲線2 道 27.4 ±3.7 28.2 ±4.1 29.8 ±4.7結(jié)扎絲線3 道 24.1 ±4.0 24.9 ±5.2 25.5 ±4.1結(jié)扎絲線4 道 22.7 ±5.2 21.2 ±5.1 22.1 ±5.9結(jié)扎羊腸線2 道 21.2 ±3.3 20.9 ±4.1 20.1 ±4.3結(jié)扎羊腸線3 道 21.2 ±3.5 19.4 ±3.7 20.4 ±4.0結(jié)扎羊腸線4道19.9 ±3.3 19.8 ±3.8 19.0 ±4.1

圖3 絲線、羊腸線及結(jié)扎道數(shù)對(duì)大鼠CCI模型痛閾值的影響（n=6）

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛包括痛覺(jué)過(guò)敏(對(duì)疼痛刺激的敏感性增加)和痛覺(jué)異常(正常情況下無(wú)害刺激所誘發(fā)的疼痛)2種情況.神經(jīng)型疼痛往往很頑固，它常給患者帶來(lái)極大的痛苦，慢性疼痛折磨著約20%的人口［6］，雖然目前有許多止痛藥物可用于鎮(zhèn)痛，例如阿片類藥物，非甾體類抗炎藥和各種輔助劑［7］，但這些藥物并不能治愈疼痛，并且易產(chǎn)生耐受性，在慢性疼痛患者的治療過(guò)程中往往需要增加藥物的劑量才能產(chǎn)生相同的鎮(zhèn)痛效果［8］.所以鎮(zhèn)痛藥物的研究與開(kāi)發(fā)一直是熱點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出鎮(zhèn)痛效果好、無(wú)成癮性的新型鎮(zhèn)痛藥變得日益重要.

大鼠CCI模型在鎮(zhèn)痛藥理學(xué)研究中是一種常用的動(dòng)物模型，它能很好地模擬患者由于外周神經(jīng)損傷所致的神經(jīng)病理性疼痛.此模型是通過(guò)人為地造成慢性壓迫坐骨神經(jīng)，使部分神經(jīng)系統(tǒng)受到擠壓而造成神經(jīng)水腫，這種損傷短時(shí)間內(nèi)就可以顯現(xiàn)出來(lái).參考多篇文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在CCI模型制作過(guò)程中多數(shù)選用雄性大鼠，推測(cè)這是因?yàn)槌赡甏菩源笫笤谏碇芷跁r(shí)激素分泌水平有差別，為避免對(duì)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性造成影響，實(shí)驗(yàn)選用了成年雄性大鼠.在神經(jīng)結(jié)扎時(shí)，常用的材料主要是羊腸線和絲線2種，羊腸線是一種異體蛋白，在其被組織吸收的過(guò)程中，它會(huì)使機(jī)體發(fā)生非特異性炎癥反應(yīng)，鉻制羊腸線用鉻酸處理過(guò)，它不但能減慢組織吸收的速度，還可以增加其抗張強(qiáng)度，延長(zhǎng)維持應(yīng)力的時(shí)間.MAVES等［9］認(rèn)為，由于鉻制羊腸線可被機(jī)體吸收，它所含的化學(xué)物質(zhì)可使大鼠產(chǎn)生與人類相似的炎性疼痛反應(yīng)，因此可以認(rèn)為，CCI模型具有神經(jīng)病理性疼痛和炎性疼痛的雙重成分.而使用絲線結(jié)扎神經(jīng)所致疼痛主要是由于神經(jīng)壓迫所致，沒(méi)有產(chǎn)生非特異性炎癥所致的炎性疼痛因素.在大鼠CCI模型中，結(jié)扎材料的不同及結(jié)扎道數(shù)的不同都會(huì)對(duì)大鼠CCI模型是否成功產(chǎn)生影響，不管用什么材料來(lái)結(jié)扎坐骨神經(jīng)，都是通過(guò)擠壓神經(jīng)所致，所以結(jié)扎時(shí)的力度很重要，一定要把握好，太緊容易阻斷神經(jīng)的血運(yùn)，太松起不到擠壓神經(jīng)的效果，這一點(diǎn)需要特別注意.TANCK［10］認(rèn)為，在CCI模型上若實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡較大，則不會(huì)產(chǎn)生觸誘發(fā)痛，這會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性.

HAMA等人［11］利用此模型來(lái)研究曲馬多的鎮(zhèn)痛效果是否均衡，藥物的作用機(jī)理是否隨時(shí)間的改變而改變.此模型也幫助JOSEPH確定［12］ZZ-204G是一種作用于α9α10乙酰膽堿受體的小分子拮抗劑，是一種新型結(jié)構(gòu)的鎮(zhèn)痛劑，它在治療慢性炎癥和神經(jīng)性疼痛方面有潛在的應(yīng)用前景.NARMATHA［13］利用大鼠CCI模型確定α－芋螺毒素Vc 1.1可以提高大鼠的痛閾值，并且可通過(guò)不同的部位給藥(手術(shù)側(cè)后肢，對(duì)側(cè)后肢)修復(fù)大鼠的受損神經(jīng)，故確定其對(duì)大鼠的受損神經(jīng)有修復(fù)作用.RICHARD［14］認(rèn)為，用未成年大鼠制作CCI模型更易誘發(fā)炎性疼痛，與人類新生兒神經(jīng)受損后的臨床表現(xiàn)一致，這有利于研究人員進(jìn)一步探索神經(jīng)痛的發(fā)病機(jī)理和治療方法.

在神經(jīng)疼痛模型中也常用到大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎(SNL)模型，SNL模型雖然有利于在脊髓水平研究星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的變化，但由于其對(duì)大鼠的損傷較大而不利于大量制備.WOOLF［15］提出了另外一種制作大鼠疼痛模型的方法，即大鼠坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷(SNI)神經(jīng)病理痛模型，它是通過(guò)結(jié)扎并剪斷坐骨神經(jīng)分支脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)，保留并避免損傷腓腸神經(jīng)來(lái)建立的.

鎮(zhèn)痛藥物的研究是目前醫(yī)學(xué)中最活躍的領(lǐng)域之一，由于疼痛的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，因此各種疼痛模型的制備顯得尤為重要.在研究神經(jīng)病理性疼痛的過(guò)程中，動(dòng)物模型的建立、完善及改進(jìn)也是一個(gè)需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題，所以近幾年來(lái)本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)芋螺毒素鎮(zhèn)痛作用研究的過(guò)程中也對(duì)大鼠的CCI模型進(jìn)行了適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，分析和比較了改變結(jié)扎道數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.筆者認(rèn)為，在建立大鼠CCI模型中，首選鉻制羊腸線，推薦使用2道結(jié)扎法.目前，本實(shí)驗(yàn)室正用大鼠CCI模型對(duì)被譽(yù)為“海洋藥物寶庫(kù)”的海南產(chǎn)芋螺毒素進(jìn)行鎮(zhèn)痛活性的篩選，已篩選出鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)大、作用靶點(diǎn)清楚、無(wú)成癮性的新型芋螺毒素先導(dǎo)藥物，為下一步原創(chuàng)鎮(zhèn)痛新藥的研發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).

［1］LUIS R，HARALD B，HELGE R，et al.Chronic pain and sensory changes after augmentation mammoplasty:Long term effects of preincisional administration of methylprednisolone［J］.Pain，2006，124:92 －99.

［2］JI R R，KOHNO T，MOORE K A，et al.Central sensitization and LTP:do pain and memory share similar mechanism［J］.Trends Neurosci，2003，26:696 －705.

［3］HERRERO J F，LAIRD J M，LOPEZ-GARCIA J A.Wind-up of spinal cord neurones and pain sensation:much ado about something［J］.Prog Neurobiol，2000，61(2):169 －203.

［4］LAU W K，LAU Y M，ZHANG H Q，et al.Electroacupuncture versus celecoxib for neuropathic pain in rat SNL model［J］.Neuroscience，2010，170(2):655 －661.

［5］BENNETT G J，XIE Y K.A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man［J］.Pain，1988，33:67 －107.

［6］BRENNAN F，CARR D B，COUSINS M.Pain management:a fundamental human right［J］.Pain Medicine，2007，105:205 －221.

［7］HOLTMAN J R，DWOSKIN L P，DOWELL C，et al.The novel small molecule α9α10 nicotinic acetylcholine receptor antagonist ZZ-204G is analgesic［J］.Eur J Pharmacol，2011(670):500 － 508.

［8］SOUNVORAVONG S，TAKAHASHI M，NAKASHIMA M N，et al.Disability of development of tolerance to morphine and U-50，488H，a selective κ-opioid receptor agonist，in neuropathic pain model Mice［J］.J Pharmacol Sci，2004(94):305 － 312.

［9］MAVES T J，PECHMAN P S，GEBHART G F，et al.Possible chemical contribution from chromit gut sutures produces disorders of pain sensation like those seen in man［J］.Pain，1993，54(1):57 －69.

［10］TANCK E N，KROIN J S，MCCARTY R J，el al.Effects of age and size on deveiopment of allodynia in a chronic pain model produced by a sciatic nerve ligation in rats［J］.Pain，1992，51(3):313 －316.

［11］HAMA A，SAGEN J.Altered antinociceptive efficacy of tramadol over time in rats with painful peripheral neuropathy［J］.Eur J Pharmacol，2007，559(1):32 －37.

［12］JOSEPH R H，LINDA P D，CHERYL D，et al.The novel small molecule α9α10 nicotinic acetylcholine receptor antagonist ZZ-204G is analgesic［J］.Eur J Pharmacol，2011，670(2/3):500 －508.

［13］NARMATHA S，BRUCE L，KEN G，et al.Alpha-conotoxin Vc1.1 alleviates neuropathic pain and accelerates functional recovery of injured neurones［J］.Brain Res，2005，1059:149 － 158.

［14］RICHARD F H，SUELLEN M W，MOTA P M.The ontogeny of neuropathic pain:Postnatal onset of mechanical allodynia in rat spared nerve injury(SNI)and chronic constriction injury(CCI)models［J］.Pain，2005，115(3):382 － 389.

［15］DECOSTERD I，WOOLF C J.Spared nerve injury:an animal model of persistent peripheral neuropathic pain［J］.Pain，2000，87(2):149－158.