李 丹，孫 雷，畢言鋒，徐 倩，王鶴佳，徐士新

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 國家獸藥殘留基準(zhǔn)實驗室，北京 100081)

球蟲病是由一種單細(xì)胞原蟲進入腸道而引起的一類流行病，在畜禽球蟲病中，以雞、兔、牛和羊的球蟲病危害最大［1］。氯苯胍、常山酮、氯羥吡啶、氨丙啉均屬于化學(xué)合成類抗球蟲藥物(結(jié)構(gòu)式見圖1)，乙氧酰胺苯甲酯屬于抗球蟲藥增效劑，與多種抗球蟲藥聯(lián)合使用，這五種藥物對于多種球蟲病均有良好的治療效果。由于不規(guī)范使用，抗球蟲藥若長期、持續(xù)添加在飼料中，極容易造成藥物在肉及蛋品中出現(xiàn)殘留，危害人體健康。我國農(nóng)業(yè)部235號公告中嚴(yán)格規(guī)定此五種抗球蟲藥在牛、雞肌肉中的最高殘留限量范圍為10～500μg/kg。文獻中，采用HPLC及LC－MS/MS測定動物性組織中氨丙啉、常山酮、氯苯胍等單一藥物的報道較多，但對動物性組織中氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍五種藥物同時檢測的殘留檢測方法報道文獻較少。本研究擬采用LC－MS/MS方法建立雞、牛肌肉中氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍五種藥物的多殘留檢測方法，以期為該類藥物的殘留監(jiān)控提供科學(xué)依據(jù)。

圖1 氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1．1 儀器 ACQUITY UPLC－Quattro Premier XETM質(zhì)譜聯(lián)用儀，Waters公司;AE260電子天平，Mettler Toledo公司;Biofuge Strators高速冷凍離心機，賀利氏公司;Organomation Associates氮吹儀，Jnc公司;SIR4漩渦混合器，IKA公司。

1．2 試劑與材料 對照品:氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍，純度均大于95．0%，Dr．Ehrenstorfer EmbH 公司;乙腈、甲醇為色譜純，F(xiàn)isher公司;乙酸銨為分析純;正己烷為分析純;所用水為超純水。

1．3 標(biāo)準(zhǔn)儲備液和工作液的配制 稱取氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍對照品適量，精密稱定，分別置于10 mL棕色量瓶中，甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液;分別精密量取五種標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，置同一10 mL棕色量瓶中，用甲醇逐步稀釋成適宜濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1．4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用 50% 甲醇稀釋成濃度均為 10、50、100、200、500 ng/mL的系列混合對照溶液，量取5種濃度的混合對照溶液各1．0mL，分別用于溶解預(yù)先按提取凈化吹干后的殘留物，按照樣品前處理方法處理后作為基質(zhì)匹配系列混合對照溶液，從低濃度到高濃度測定，每一濃度進樣3針，以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．5 UPLC－MS/MS分析條件 色譜條件:色譜柱為 BEH C18色譜柱(50 mm ×2．1 mm，1．7 μm);流動相A相為乙腈，B相為20 mmol/L乙酸銨水溶液，梯度洗脫:0～4 min，5%A線性變化至100%A;4～5 min，100%A 線性變化至 5%A;5～6．5 min，維持5%A。流速0．3 mL/min，柱溫30℃，進樣量10 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI+)，毛細(xì)管電壓為3．2 kV，萃取電壓為3V，RF透鏡電壓為1V，源溫110℃，脫溶劑溫度350℃，脫溶劑氣速650 L/h，錐孔反吹氣速50 L/h。多反應(yīng)監(jiān)測各藥物離子對及對應(yīng)的錐孔電壓、碰撞能量見表1。

表1 5種藥物的定性、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量

1．6 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取絞碎后的(2±0．05)g試料，置于50mL離心管內(nèi)，加乙腈8mL，渦旋混合30 s，中速振蕩5 min，8000 r/min離心5 min后，上清液置于另一50 mL離心管內(nèi)，殘渣重復(fù)提取一次。合并兩次上清液，混勻后取出8 mL置于玻璃管中，于50℃水浴中氮氣吹干。殘余物用50%甲醇水溶液1．0 mL溶解，再加50%甲醇水溶液飽和的正己烷1．0 mL，渦旋混合30 s，靜置分層后，轉(zhuǎn)移下層溶液至1．5 mL塑料離心管內(nèi)，于 －4℃下13000 r/min離心10min后，吸適量下層溶液過0．2 μm濾膜后，供液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1．7 方法學(xué)考察

1．7．1 方法靈敏度確定 將適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到空白組織中，經(jīng)上述方法進行前處理后，用UPLC－MS/MS檢測，觀察藥物特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(S/N)和對應(yīng)藥物濃度，S/N＞3，定為方法的檢測限;S/N＞10，定為方法的定量限。

1．7．2 準(zhǔn)確度和精密度的測定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白組織中添加低、中、高三個不同濃度混合組分進行回收率試驗;各濃度進行6個樣品平行試驗，重復(fù)3次，求批內(nèi)、批間RSD。

2 結(jié)果與討論

2．1 流動相的選擇 本研究通過優(yōu)化流動相改善五種藥物的分離效果。分別試驗了甲醇－0．1%甲酸水溶液、乙腈－0．1%甲酸水溶液、0．1%甲酸乙腈－0．1%甲酸水溶液、乙腈－20 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動相，結(jié)果表明，含有乙腈的流動相均優(yōu)于含有甲醇的流動相，流動相中加入乙酸銨后，分離效果更好。因此，本方法以乙腈－20 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相進行梯度洗脫。

圖2 空白牛肌肉特征離子質(zhì)量色譜圖

2．2 前處理條件的優(yōu)化 氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍五種抗球蟲藥均屬于弱堿性化合物，易溶于酸性水溶液和極性有機溶劑。已報道的提取用溶劑有乙酸乙酯［2］、磷酸鹽緩沖液［3］、乙腈等;用液液萃取、固相萃取等方法凈化，用到的固相萃取柱有 HLB柱［4－5］、堿性氧化鋁柱［6－7］等。經(jīng)過優(yōu)化處理，本方法采用乙腈進行提取，再用正己烷去除脂肪等雜質(zhì)，使得這五種藥物獲得較高的回收率，且前處理過程簡單，省去了采用固相萃取柱凈化的步驟。

2．3 方法線性 5種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液在10～500μg/L的系列基質(zhì)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液范圍內(nèi)，呈良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 5種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

2．4 方法靈敏度、回收率和精密度 采用空白組織中添加目標(biāo)化合物的方法，得出5種藥物在樣品中的檢測限均為5μg/kg，定量限均為10μg/kg。牛肌肉基質(zhì)空白色譜圖見圖2，100μg/kg空白牛肉基質(zhì)匹配試液和100μg/kg空白牛肉添加試液中5種藥物的特征離子質(zhì)量色譜圖見圖3、圖4。

圖3 100μg/kg空白牛肌肉基質(zhì)匹配試液中五種藥物的特征離子質(zhì)量色譜圖

圖4 100μg/kg空白牛肌肉添加試液中5種藥物的特征離子質(zhì)量色譜圖

在空白牛、雞肌肉中添加100、200、500μg/kg三個不同濃度的5種混合組分進行回收率試驗，結(jié)果匯總見表3。可以看出，5種藥物在空白牛、雞肌肉中的平均添加回收率為75．4% ～109%，批內(nèi)批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。

3 結(jié)論

本研究利用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC－MS/MS)同時測定雞肉和牛肉中5種常用抗球蟲藥物，方法線性、靈敏度、回收率和精密度等參數(shù)均能滿足獸藥殘留分析方面的要求。

表3 空白牛肉、雞肉中添加5種抗球蟲藥的回收率和精密度實驗結(jié)果

［1］ 陳杖榴．獸醫(yī)藥理學(xué)［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002:283．

［2］ 曹 瑩，黃士新，沈富林，等．高效液相色譜法測定雞肝組織中的氫溴酸常山酮殘留［J］．中國獸藥雜志，2004，38(4):11－13．

［3］ 李 存，江瀟瀟，吳銀良，等．液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛組織中氨丙啉殘留量［J］．分析化學(xué)，2011，39(4):576 －579．

［4］ 劉勇軍，吳銀良，姜艷彬．高效液相色譜法測定雞組織與雞蛋中氯苯胍的殘留量［J］．色譜，2010，28(9):905 －907．

［5］ 吳秋俠，李引乾，曹玲玲，等．離子對反相高效液相色譜法測定鹽酸氨丙啉在雞肉中殘留方法的建立［J］．畜牧與獸醫(yī)，2007，39(3):38 －39．

［6］ Fang B H，Su Y J，Ding H Z，et al．Determination of Residual Clopidol in Chicken Muscle by Capillary Gas Chromatography－Negative Chemical Ionization － Mass Spectrometry［J］．Analytical Sciences，2009，25(10):1203．

［7］ Liu X G，Su Y J，F(xiàn)ang B H，et al．Determination of clopidol residues in chicken muscle by gas chromatography－mass spectrometry［J］．Chinese Journal of Chromatography，2009，27(1):86 －90．