陳小云，張 敏，張啟龍，王 磊，王 棟，蔣桃珍

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

大多數(shù)連續(xù)細胞系在大規(guī)模病毒生產(chǎn)過程中的一個重要缺陷是由于這些細胞屬于貼壁依賴性細胞，因而需要表面貼附以進行增殖。在工業(yè)化生物反應(yīng)器生產(chǎn)中，采用微載體可以提供細胞生長表面。盡管這一方案能獲得較高的病毒產(chǎn)率，但是，與全懸浮細胞增殖方案相比，這一方案還是顯得過于繁瑣。因此，構(gòu)建和應(yīng)用能在全懸浮條件下增殖的MDCK細胞系，將極大方便禽流感病毒的放大培養(yǎng)工藝。

由于 MDCK細胞自身的貼壁特性較強，與BHK－21細胞相比，采用常規(guī)的懸浮細胞馴化技術(shù)，很難直接將MDCK細胞馴化為適應(yīng)全懸浮培養(yǎng)條件的細胞。并且，由于現(xiàn)行《中國藥典》和《中國獸藥典》對用于疫苗生產(chǎn)的傳代細胞的代次范圍都有較嚴格的規(guī)定，以防傳代細胞在超過一次的代次范圍后，產(chǎn)生致腫瘤性等安全性問題。這也限制了采用長期懸浮培養(yǎng)的方法，將貼壁依賴性MDCK細胞馴化為適應(yīng)全懸浮培養(yǎng)細胞的策略。因此，有必要嘗試采取其他更為快捷而有效的馴化方法。已有的研究表明，將控制細胞帖壁生長特性的人類siat7e基因，轉(zhuǎn)染MDCK細胞，能夠使該細胞失去貼壁依賴特性，從而適應(yīng)懸浮培養(yǎng)環(huán)境［1］。

此外，流感病毒通過其表面的血凝素(HA)與細胞表面唾液酸寡糖受體結(jié)合侵染宿主細胞。禽流感病毒傾向識別 α－2，3連接型受體(NeuAc α －2，3－Gal)，而人流感病毒傾向識別 α －2，6連接型受體(NeuAcα－2，6－Gal)。目前 H5N1和H9N2亞型流行株仍保持典型的 NeuAcα－2，3－Gal受體結(jié)合傾向性，因此，提高 MDCK工程細胞系表面受體豐度，有可能改進禽流感病毒分離株的生長滴度及蝕斑形成能力。

為此，本研究克隆了編碼人的唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST6GalNacⅤ的siat7e基因，以及雞 β－半乳糖苷α－2，3－唾液酸轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(st3galⅠ)基因，并將它們構(gòu)建在同一個真核表達載體，進行雙基因表達，以期構(gòu)建能夠適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，并且對禽流感病毒更加易感的MDCK細胞系，為應(yīng)用MDCK細胞規(guī)?；a(chǎn)禽流感疫苗奠定基礎(chǔ)，并為其他貼壁細胞的懸浮馴化提供新思路。

1 材料與方法

1．1 菌株與載體 受體菌DH5α購自北京紐樸生物技術(shù)開發(fā)中心;pMD18－T載體購自寶生物工程有限公司。真核表達載體pReceiver，本室保存。

1．2 試劑 基因組提取試劑盒 QIAamp? DNA Mini Kit，QIAGEN公司產(chǎn)品;Taq DNA聚合酶、DL－2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、限制性內(nèi)切酶Bam H I、PstⅠ、Sac I和 Xho I、IPTG、X － Gal、dNTP，寶生物有限公司;氨芐青霉素、瓊脂糖凝膠，Sigma公司;DNA片段玻璃奶快速純化回收試劑盒，博大泰克生物基因技術(shù)有限公司;質(zhì)粒小量快速提取試劑盒，北京天根生物技術(shù)公司。

1．3 人和雞基因組DNA的提取 參照基因組提取試劑盒QIAamp? DNA Mini Kit的說明書中介紹的血液中基因組提取方法進行，并稍作修進。具體步驟如下:取1．5 mL 血液，10000 ×g離心2 min，棄上清;用180μL酶裂解緩沖液重懸沉淀，37℃作用45 min;加25μL蛋白酶K和200μL緩沖液AL，渦旋混勻，70℃作用30 min;加200μL無水乙醇，渦旋混勻后，加入DNeasy微型離心柱上，8000×g離心1 min;將DNeasy微型離心柱放入一個新的2mL收集管中，加入500μL緩沖液AW2，14000×g離心5 min;將DNeasy微型離心柱放入一個新的1．5 mL eppendorf管中，加入200 μL 緩沖液 AE，室溫放置1 min，8000×g離心1 min，濾出液即為純化后基因組DNA溶液。

1．4 引物設(shè)計 參考GenBank中已登錄的siat7e基因st3gal I基因序列，利用Oligo6．0軟件，自行設(shè)計并合成了2對引物，其中引物對 V1581U/V1581L，用于擴增siat7e基因。這對引物的擴增產(chǎn)物包含了完整的siat7e基因序列，并在ORF兩端引入了便于進一步克隆的兩個酶切位點BamH I和PstⅠ(下劃線表示)。預(yù)期的擴增產(chǎn)物大小為1027 bp。引物對C0384U/C0384L，用于擴增st3gal I基因。這對引物的擴增產(chǎn)物包含了完整的st3gal I基因序列，并在 ORF兩端引入了便于進一步克隆的兩個酶切位點 Sac I和Xho I(下劃線表示)。預(yù)期的擴增產(chǎn)物大小為1047 bp。具體引物序列如下:

1．5 PCR擴增 以純化后的人和雞基因組DNA為模板，進行PCR擴增。采用50μL反應(yīng)體系:10 ×Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，10 mmol/L dNTP 2μL，25 mmol/L的上下游引物各1μL，模板DNA 5 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0．5 μL，補加滅菌超純水至總體積50μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，加入 Taq DNA聚合酶;94℃ 40 S，52℃40 S，72℃ 80 S，共進行31個循環(huán);最后72℃延伸10 min。取8μL PCR產(chǎn)物，用1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴增結(jié)果。

1．6 PCR產(chǎn)物的純化、酶切、連接與轉(zhuǎn)化 用1．5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，切下目的條帶，用DNA片段玻璃奶快速純化回收試劑盒回收。連接時，首先將V1581U/V1581L引物對的擴增產(chǎn)物，以及C0384U/C0384L引物對的擴增產(chǎn)物，分別與pMD18－T載體連接，在0．5 mL eppendorf管中加入1μL pMD18－T載體和4μL純化后的PCR產(chǎn)物，再加入5μL Ligation SolutionⅠ，16℃反應(yīng)30 min;取出5μL，加入與DH5α感受態(tài)細胞配套的溶液A(10μL)和溶液B(35μL);加入50μL感受態(tài)細胞，冰上放置20 min，再室溫放置10 min;再加入 200μL LB培養(yǎng)基，37℃ 150 rpm振蕩40 min;取200μL菌液涂布于LB/Amp+/XGal/IPTG平板上，37℃培養(yǎng)過夜(12－16 h)，觀察菌落生長情況，根據(jù)藍白斑篩選重組轉(zhuǎn)化菌。得到的重組質(zhì)粒分別命名為pMD18－V1581和pMD18－C0384。

1．7 重組PCR產(chǎn)物質(zhì)粒的酶切及真核表達載體的構(gòu)建及鑒定 將pMD18－V1581質(zhì)粒及重組表達載體pReceiver，分別用內(nèi)切酶Bam H I和PstⅠ進行雙酶切，連接，得到重組載體pRE－SIAT。再將pMD18－C0384質(zhì)粒及構(gòu)建的重組載體 pRESIAT用內(nèi)切酶Sac I和Xho I進行雙酶切，連接，獲得pRE－SIAT－ST3重組真核表達載體。轉(zhuǎn)化DH5α細胞，挑取白色菌落，經(jīng)培養(yǎng)后采用質(zhì)粒小量快速提取試劑盒提取質(zhì)粒。從載體pRE－SIAT－ST3中選擇位于插入片段兩側(cè)的兩個酶切位點Bam H I/PstⅠ，以及內(nèi)切酶Sac I/Xho I進行雙酶切鑒定。將酶切鑒定的重組質(zhì)粒用無菌超純水稀釋100倍，取1μL為模板，采用前述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行PCR擴增。同時，采用PCR上游引物作為測序引物，對酶切和PCR鑒定呈陽性的重組質(zhì)粒進行序列測定。由北京三博遠志公司完成。

1．8 重組載體pRE－SIAT－ST3電轉(zhuǎn)化MDCK細胞 采用德國QIAGEN公司質(zhì)粒純化試劑盒，提取pRE－SIAT－ST3質(zhì)粒，并將質(zhì)粒濃度調(diào)整為1μg/mL。將MDCK細胞擴大培養(yǎng)后，胰酶消化，離心后，作細胞計數(shù)，并用BioRAD公司的電擊緩沖液，將細胞濃度調(diào)整為1．1×106活細胞/mL。取10μL質(zhì)粒，加入90μL細胞懸液，采用BioRAD電轉(zhuǎn)化儀，在0．2 cm電擊杯中進行電擊。電擊條件為:150 V，5 ms。電擊后，立即將細胞輕柔加入到含有5mL完全生長培養(yǎng)液的6孔細胞板內(nèi)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時，設(shè)立未轉(zhuǎn)化的正常MDCK細胞對照。

1．9 轉(zhuǎn)化細胞的熒光觀察 將電轉(zhuǎn)化的MDCK細胞，在6孔板中培養(yǎng)24小時后，采用Olympus IX71倒置熒光顯微鏡，進行熒光顯微鏡觀察。由于表達載體pRE－SIAT－ST3中帶有eGFP序列，因此，轉(zhuǎn)化后的MDCK細胞，應(yīng)可觀察到綠色熒光。

2 結(jié)果與分析

2．1 siat7e基因和st3gal I基因的擴增 在進行了31個循環(huán)的擴增后，經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳，并與DL－2000標(biāo)準(zhǔn)分子量比較，結(jié)果表明，得到了大小分別為1027 bp和1047 bp的siat7e基因和st3gal I基因片段(圖1)。

圖1 siat7e基因和st3gal I基因的PCR擴增

重組表達載體的鑒定將構(gòu)建的重組真核表達載體pRE－SIAT－ST3，分別采用兩組內(nèi)切酶，即內(nèi)切酶Bam H I/PstⅠ以及內(nèi)切酶Sac I/Xho I，分別進行雙酶切鑒定，均能得到預(yù)期大小的片段。采用引物對V1581U/V1581L和C0384U/C0384L進行PCR鑒定，得到的PCR產(chǎn)物大小，也與預(yù)期一致(圖2)。同時，采用PCR的上游引物，對重組載體進行序列測定，結(jié)果表明，序列是正確的。

圖2 siat7e基因和st3gal I基因的PCR擴增

2．3 電轉(zhuǎn)化細胞的熒光顯微鏡觀察 采用Olympus IX71倒置熒光顯微鏡，通過觀察載體自帶的eGFP熒光蛋白的表達情況，驗證外源基因的表達情況。由于eGFP位于外源基因的C端，因此，從理論上講，只有充分表達外源基因后，eGFP才會得到表達。觀察結(jié)果表明，與對照細胞相比，電轉(zhuǎn)化MDCK細胞可見明顯的綠色熒光，證明eGFP基因得到了有效的表達(結(jié)果見圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)染雙基因真核表達載體的MDCK細胞的熒光觀察

3 討論

目前，工業(yè)化生產(chǎn)流感疫苗，已有若干細胞系可供選擇。但是，一方面新近發(fā)展起來細胞系，如人PER．C6、鴨 EB66或鴨 AGE1．CR 細胞等，這些細胞系是為了疫苗生產(chǎn)而特別研制的，通常在無血清條件下懸浮培養(yǎng)。然而，除了PER．C6細胞外，對于大規(guī)模生產(chǎn)中的細胞生長和病毒復(fù)制僅僅進行了極少的研究，背景研究資料的匱乏反過來限制了這些新細胞系的進一步應(yīng)用。更為重要的是，這些細胞系都受到了嚴格的專利保護;另一方面，可以通過商業(yè)途徑獲得的貼壁細胞系，如綠猴腎細胞(Vero)或MDCK細胞，是當(dāng)前流感疫苗生產(chǎn)最有希望的哺乳動物細胞系，并且多年來已對這兩個細胞系進行了較為系統(tǒng)和詳盡的研究。其中MDCK細胞是培養(yǎng)和分離流感病毒的最佳哺乳動物細胞系，此細胞系具有感染后迅速產(chǎn)生流感病毒、在短時間內(nèi)取得高滴度和產(chǎn)生的流感病毒血凝素(HA)含量高等特點，并且可用于增殖大多數(shù)流感病毒。更為重要的是，采用MDCK細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的疫苗，其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，與雞胚源疫苗一樣良好［2］。美國富道公司實驗室已經(jīng)將MDCK細胞系應(yīng)用到馬流感疫苗的生產(chǎn)中，這種流感疫苗生產(chǎn)工藝的轉(zhuǎn)變使生產(chǎn)成本下降到雞胚培養(yǎng)工藝的40%，而抗原的效力卻提高了3倍，同時消除了外源因子污染的危險。有研究者比較了在不同類型微載體上培養(yǎng)的MDCK細胞，與雞胚之間在增殖A型流感病毒能力上的差異，發(fā)現(xiàn)在攪拌瓶培養(yǎng)的以Cytodex I為微載體的細胞，其毒價上可達5．0×104HAU/mL，而雞胚則為2．0×105HAU/mL。根據(jù)這一數(shù)據(jù)，他們估算在固相微載體上培養(yǎng)的1000 L MDCK細胞，約等于30000枚雞胚，或者說是1 L等于30枚雞胚［2］。

研究者通過采用DNA微矩陣的方法，比較了貼壁依賴性和貼壁非依賴性Hela細胞的轉(zhuǎn)錄譜，發(fā)現(xiàn)siat7e(ST6GalNacⅤ)是控制細胞貼壁程度的重要基因［3］。通過顯微評估和監(jiān)測細胞在剪切流體腔中的脫壁情況，發(fā)現(xiàn)更高水平的siat7e基因轉(zhuǎn)錄對應(yīng)于更低程度的細胞貼壁，而用siRNA抑制siat7e基因轉(zhuǎn)錄，能顯著增強細胞的貼壁功能。siat7e基因編碼人的唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST6GalNacⅤ，該酶屬于唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST6GalNac家族的成員，是一種Ⅱ型高爾基膜蛋白，能將唾液酸從供體CMPNeu5Ac轉(zhuǎn)移至神經(jīng)節(jié)苷脂GalNac殘基GM1b上，形成GD1α［4］。國外已有研究者將siat7e基因轉(zhuǎn)染MDCK細胞，成功獲得了適應(yīng)懸浮培養(yǎng)環(huán)境的MDCK細胞系［1］。

本研究構(gòu)建的siat7e基因和st3galⅠ基因雙基因真核表達載體，在轉(zhuǎn)化MDCK細胞后，若能使MDCK細胞適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，并且對禽流感病毒更加易感，為極大地方便應(yīng)用MDCK細胞規(guī)?；a(chǎn)禽流感疫苗。目前，我們已通過本研究獲得了該載體，并在將該真核表達載體電轉(zhuǎn)化MDCK細胞后，成功觀察到了外源基因eGFP的表達，初步證實我們構(gòu)建的真核表達載體pRE－SIAT－ST3已成功轉(zhuǎn)化至MDCK細胞，并得到了有效表達。下一步，我們將進一步研究載體中的兩個外源基因siat7e基因和st3gal I基因的表達情況，以及轉(zhuǎn)化后MDCK細胞的表型特征，特別是其適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的特性，以及對禽流感病毒的敏感性。