歐陽(yáng)永中， 李 操， 姜翠翠， 張興磊， 肖賽金， 朱志強(qiáng)

(東華理工大學(xué)江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330013)

雞蛋由于含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、維生素、礦質(zhì)元素等營(yíng)養(yǎng)成分，通常是人們滋補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)的首選。與普通雞蛋相比，脂肪含量相對(duì)較低的烏雞蛋，更加深受廣大消費(fèi)者的歡迎(程瑛琨等，2005)。通過飼料配比來(lái)調(diào)控雞蛋的營(yíng)養(yǎng)成分是目前養(yǎng)殖業(yè)常用的技術(shù)手段(吳孝兵等，2001;李瑞，2007)。投喂含有中藥的飼料往往會(huì)改變雞蛋的品質(zhì)(牛麗鳳等，2010)。葛根含有葛根素、大豆苷、大豆苷元等有效藥用成分，具有降血壓、止瀉、抗心律失常等功效。人參含有多種人參皂甙，具有抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)體力等功效。研究表明，飼喂葛根對(duì)母雞的血脂水平和雞蛋膽固醇含量有影響(Kanpai et al.，2004;Martinez et al.，2001);飼喂人參可以提高雞蛋品質(zhì)和產(chǎn)蛋量，降低雞蛋膽固醇的含量，提高雞蛋黃不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的比例(Ao et al.，2011;Yan et al.，2011)。

雞蛋清和蛋黃粘稠，很難直接進(jìn)行分析。傳統(tǒng)分析雞蛋中營(yíng)養(yǎng)成分的方法，都需要對(duì)樣品進(jìn)行提取和分離，操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)。質(zhì)譜法因?yàn)槠潇`敏度高，特異性強(qiáng)，廣泛用于食品分析、無(wú)機(jī)元素檢測(cè)(肖愛芳等，2012)等領(lǐng)域。新型常溫常壓離子源質(zhì)譜分析技術(shù)，由于具有無(wú)需樣品預(yù)處理或很少樣品制備、在大氣壓下操作等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到人們的關(guān)注(楊水平等，2012)。中性解吸電噴霧萃取電離質(zhì)譜技術(shù)(Neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry，ND-EESI-MS)，是一種能直接對(duì)粘稠物樣品進(jìn)行快速分析的新興離子化技術(shù)，已被用于香水(Chingin et al.，2009)、啤酒(Zhu et al.，2010)、蜂蜜(Law et al.，2009a)、食用油(Law et al.，2009b)、牙膏(Ding et al.，2009)等粘稠樣品的直接分析(Li et al.，2011)。本文以不同配比的飼料飼喂的烏雞蛋為研究對(duì)象，通過獲得不同烏雞蛋樣品的ND-EESI-MS指紋譜圖，結(jié)合主成分分析方法(PCA)(張建喜等，2011)，研究投喂中藥飼料對(duì)烏雞蛋品質(zhì)的影響。初步研究表明，本方法可以從分子水平觀察飼料對(duì)雞蛋品質(zhì)的微小影響，這將為實(shí)時(shí)監(jiān)控養(yǎng)殖過程提供技術(shù)思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

LTQ-XL型線性離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó)Finnigan公司);Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó) Finnigan公司);中性解吸電噴霧萃取離子源(ND-EESI)(實(shí)驗(yàn)室自制)。

甲醇(色譜醇，美國(guó)Fisher有限公司);乙酸(化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。四種烏雞蛋樣品(江西南豐某養(yǎng)殖場(chǎng)提供)，其中玉米飼喂烏雞蛋是用玉米飼喂的烏雞蛋，加有人參飼喂烏雞蛋、加有葛根飼喂烏雞蛋、普通烏雞蛋的基礎(chǔ)飼料是玉米-大豆餅粕，人參飼喂和葛根飼喂烏雞蛋是在基礎(chǔ)飼料中分別加有人參須根和葛根。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

設(shè)置EESI-MS為正離子檢測(cè)模式，質(zhì)量掃描范圍為100～600 Da，噴霧電壓為1.0 kV，噴霧氣體壓力為:1.4 MPa，噴霧溶劑流速為 5 μL/min，噴霧溶劑為甲醇/水/乙酸溶液(50∶48∶2，v∶v∶v)，中性解吸氣體(氮?dú)?氣壓為0.2 MPa。離子傳輸管溫度為275℃。其他條件由儀器自動(dòng)優(yōu)化。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

取四種新鮮烏雞蛋，將蛋清和蛋黃分開。分別取2 mL雞蛋清、雞蛋黃樣品，放置于10 mL容量瓶中，直接進(jìn)行質(zhì)譜分析。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定10次，為了防止交叉污染，測(cè)定完每個(gè)樣品后用甲醇水溶液對(duì)樣品管道進(jìn)行清洗。獲得的ND-EESI質(zhì)譜圖，用Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)導(dǎo)入到Excel，以質(zhì)荷比和質(zhì)譜指紋譜圖的強(qiáng)度為變量，導(dǎo)入到Matlab進(jìn)行PCA分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 烏雞蛋樣品的EESI-MS指紋圖譜

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，無(wú)需任何預(yù)處理過程，直接對(duì)4種烏雞蛋樣品進(jìn)行分析，把正離子模式下獲得的4種烏雞蛋樣品的全掃描一級(jí)質(zhì)譜作為指紋譜圖。4種烏雞蛋清樣品和蛋黃樣品的指紋譜圖如圖1和圖2所示，具有顯著信號(hào)強(qiáng)度的質(zhì)量范圍為m/z 120～300。因?yàn)殡u蛋樣品具有較高的粘性，樣品中的大分子物質(zhì)難以被解吸出來(lái)，所以質(zhì)量范圍大于m/z 400的離子信號(hào)較少。雞蛋清樣品都具有明顯的 m/z 144，164，196，236，250，269，293，391信號(hào)，而雞蛋黃樣品除了具有上述較強(qiáng)的信號(hào)外，還具有明顯的m/z 437信號(hào)，而且m/z 144的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度要高于雞蛋清樣品中的強(qiáng)度。玉米飼喂的雞蛋樣品的上述離子的信號(hào)都明顯要弱于其它飼料飼喂的雞蛋樣品的信號(hào)。這可能是因?yàn)橐杂衩缀痛蠖癸炂蔀榛A(chǔ)飼料的雞蛋樣品，大豆餅粕中的蛋白質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分要高于玉米中的營(yíng)養(yǎng)成分。四種烏雞蛋樣品的指紋譜圖基本相似，但是不同飼料飼喂的雞蛋樣品各離子信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度不一樣，表明電噴霧萃取電離源對(duì)雞蛋這種粘稠樣品具有很好的離子化效果。

圖1 不同飼料飼喂的烏雞蛋清樣品的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 The EESI full scan mass spectra of dark egg white with different feed additives

圖2 不同飼料飼喂的雞蛋黃樣品的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 The EESI full scan mass spectra of dark egg yolk with different feed additives

2.2 質(zhì)譜信號(hào)的主成分分析

主成分分析方法(PCA)是一種能夠把多個(gè)變量劃為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)的一種統(tǒng)計(jì)分析方法(Jia et al.，2010;Wu et al.，2009;Zhang et al.，2010)。在本文中，利用該方法，通過對(duì)4種烏雞蛋清和蛋黃共80份樣品的一級(jí)質(zhì)譜指紋譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，對(duì)不同飼料飼喂的烏雞蛋樣品進(jìn)行了區(qū)分和檢測(cè)。圖3給出了雞蛋清和雞蛋黃樣品的ND-EESI-MS指紋譜圖數(shù)據(jù)的PCA分析結(jié)果。

圖3 四種雞蛋樣品的PCA得分圖Fig.3 3D plot of PCA score results for 5 different kinds of dark egg using the EESI full scan mass spectra

如圖3所示，對(duì)于雞蛋清樣品，選擇PC1，PC2，PC3前三個(gè)主成分用于構(gòu)建模型，變量的百分?jǐn)?shù)分別為64.13%，12.09%，6.18%，其中 PC1 描述了數(shù)據(jù)集合中最大變量的方向。在PC2方向上能將玉米飼喂的雞蛋清樣品和其它的樣品區(qū)分開來(lái)，并且其它三種雞蛋清樣品相對(duì)集中在一個(gè)區(qū)域。由于玉米飼喂雞蛋的基礎(chǔ)飼料為玉米，而其它三種雞蛋樣品的基礎(chǔ)飼料都是玉米-餅粕(Swennen et al.，2004)，表明玉米飼喂和玉米-餅粕飼喂的蛋清樣品不一樣。

對(duì)于雞蛋黃樣品，同樣的選擇 PC1，PC2，PC3前三個(gè)主成分用于構(gòu)建模型，變量的百分?jǐn)?shù)分別為26.61%，18.43%，11.61%。在 PC1 方向上，玉米飼喂的雞蛋樣品和其它三個(gè)樣品能夠區(qū)分開來(lái)，其它的三個(gè)樣品也相對(duì)集中在一個(gè)區(qū)域。而在PC2方向上，四種雞蛋黃樣品都能非常好的區(qū)分開來(lái)。添加有人參和葛根中藥飼喂的雞蛋樣品能和其它樣品也能區(qū)分開來(lái)，表明添加中藥飼料對(duì)雞蛋黃的營(yíng)養(yǎng)成分存在一定的影響。

根據(jù)PCA分析結(jié)果，可以觀察到投喂不同中藥飼料對(duì)烏雞蛋黃的影響，但是不能觀察到對(duì)雞蛋清成份的影響。主要可能有以下兩種原因:一是蛋清樣品和蛋黃樣品成分差異。雞蛋清的成分比較單一，主要有蛋白質(zhì)、水分和很少量的脂肪，而蛋黃的成分復(fù)雜，除了蛋白質(zhì)外還含有多種礦質(zhì)元素、維生素、膽固醇等多種營(yíng)養(yǎng)成分，而且脂肪含量比蛋清中的含量要高的多，飼喂葛根和人參對(duì)膽固醇影響較大(Kanpai et al.，2004;Jang et al.，2007)。雞蛋黃樣品的成分更為復(fù)雜，更容易受到加有中藥飼料的影響。二是蛋清和蛋黃在母雞體內(nèi)的形成時(shí)間不同。在雞蛋形成過程中，卵子經(jīng)9～10 d成熟后，排出卵泡到達(dá)蛋白分泌部，在蛋白分泌部停留3 h包上蛋白，包上蛋白的卵在子宮內(nèi)滲入子宮液、包上蛋殼。在整個(gè)過程中蛋黃在體內(nèi)停留的時(shí)間要長(zhǎng)，受到影響的時(shí)間長(zhǎng)。因此，投喂加有中藥的飼料對(duì)雞蛋品質(zhì)的影響在蛋黃品質(zhì)上更容易表現(xiàn)出來(lái)。

2.3 分析速度和精確度

圖4是檢測(cè)加有葛根飼喂雞蛋清樣品的離子流圖，11次進(jìn)樣單個(gè)樣品的分析時(shí)間在3 min內(nèi)，表明ND-EESI-MS的檢測(cè)速度快，適合大批量樣品的高通量快速分析。玉米飼喂的烏雞蛋、加有葛根飼喂烏雞蛋、普通烏雞蛋樣品、加有人參飼喂烏雞蛋的10次進(jìn)樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為:6.0%，8.6%，10.1%，8.2%，說(shuō)明 ND-EESI-MS 方法的精確度高，適于粘稠的雞蛋樣品的快速分析。加有玉米飼喂的烏雞蛋樣品精確度最高，可能是因?yàn)轱暳铣煞謫我弧?/p>

3 結(jié)論

圖4 添加葛根飼喂的烏雞蛋清樣品的離子流圖Fig.4 The ion current of dark egg white with the feed additives of root of kudzuvine

采用ND-EESI-MS技術(shù)與PCA相結(jié)合的方法，在無(wú)需樣品預(yù)處理的前提下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同飼料配比飼喂的雞蛋樣品的直接分析。由于主成分分析方法能依據(jù)成分對(duì)分類貢獻(xiàn)的大小進(jìn)行數(shù)據(jù)提取，其優(yōu)點(diǎn)就是能對(duì)數(shù)據(jù)的微小差異進(jìn)行放大和可視化，肉眼下差異很小的數(shù)據(jù)，可能在成分貢獻(xiàn)上很明顯，通過PCA分析，能很好進(jìn)行判別分類。實(shí)驗(yàn)證明，ND-EESI-MS結(jié)合PCA的方法可以區(qū)分不同飼料飼喂的雞蛋，能夠觀察到中藥飼喂對(duì)烏雞蛋黃的影響，是一種強(qiáng)大的分析方法。本論文的研究擴(kuò)大了ND-EESI-MS用于粘稠樣品分析的應(yīng)用范圍，也為研究飼料對(duì)雞蛋品質(zhì)的影響提供技術(shù)思路。

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