李 敏， 梁 波， 于梁梁， 徐 瓊

(1.東華理工大學放射性地質(zhì)與勘探技術(shù)國防重點學科實驗室，江西南昌 330013;2.東華理工大學化學生物與材料科學學院，江西南昌 330013)

生物吸附法是目前處理工業(yè)廢水的有效方法之一(吳志良等，2008)。目前已有多種微生物被用于重金屬離子的生物吸附，包括藻類、細菌、真菌及酵母等(Wang et al.，2009)。其中，釀酒酵母已被證明對 Cu2+，Cr3+，Pb2+，Hg2+，Cd2+，As3+等多種金屬離子具有較強的吸附能力(Wang et al.，2006;Zhang et al.，2009;Peng et al.，2010;楊靜靜等，2011;Wu，et al.，2012)，而對 Pb2+，Hg2+的親和力顯著高于Cu2+，Cr3+等金屬離子(Dhankhar et al.，2011)。對于重金屬離子的生物吸附研究，盡管目前已經(jīng)取得了一定的進展，然而對于如何進一步提高微生物的吸附量，仍是亟需解決的主要問題(Kiyono et al.，2006;Chen et al.，2007;Ghorbani et al.，2011)。

目前對于微生物吸附包括鉛在內(nèi)的重金屬的研究機制認為，微生物細胞對重金屬離子的生物吸附主要是通過與細胞壁表面的一些基團形成離子或共價鍵來實現(xiàn)。除此之外，微生物細胞還可以通過離子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，把重金屬離子轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)部，并與細胞內(nèi)大分子物質(zhì)的功能基團相結(jié)合，從而將金屬離子積累在細胞內(nèi)(Lin et al.，2011)。這種在微生物細胞中表達金屬絡(luò)合物，增強金屬離子在細胞內(nèi)的積累，已成為提高細胞吸附容量的一條有效途徑。金屬硫蛋白(MTs)就是這類物質(zhì)最典型的代表，MTs已被證明可以有效地結(jié)合 Hg2+，Cd2+，Ag+，Zn2+，Cu2+等金屬陽離子(Su et al.，2009;方彩云等，2011)，不同物種及不同亞型的MTs對重金屬的吸附能力各不相同，其中人類的金屬硫蛋白絡(luò)合能力最強。本研究將人源的金屬硫蛋白基因(mt)轉(zhuǎn)化入酵母細胞中，并研究了工程細胞對水溶液中Pb2+的吸附能力。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)菌株和質(zhì)粒。釀酒酵母菌株INVSC1(histrp－leu－ura－)、穿梭質(zhì)粒 pYES2(ura+Ampr)、大腸桿菌(E.coli)DH5α均為本實驗室保存。

(2)酶及主要試劑。限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶均購于Fermentas公司;DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購于TIANGEN公司;引物合成及測序由上海生工生物工程有限公司完成;Pb(NO3)2及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 金屬硫蛋白基因(mt)的獲得

根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫中的人肝金屬硫蛋白的基因序列，結(jié)合釀酒酵母的密碼子使用規(guī)律，改造并合成可在釀酒酵母中高效表達的金屬硫蛋白基因(mt)，并將基因連接在pUC57載體的Bam HI/Xho I酶切位點處。mt基因序列如下:

GGATCCATGGACCCAAACTGCTCCTGCGC

TACTGGTGGTTCCTGCACCTGCACTGGT

TCCTGCAAATGCAAAGAATGCAAATGCAC

CTCCTGCAAGAAGTCTTGCTGCTCCTGCT

GCCCAATGTCTTGTGCTAAGTGTGCT

CAAGGTTGCATCTGCAAAGGTGCAT

CAGAAAAGTGCTCTTGCTGTGCTCTCGAG

1.2.2 酵母表達載體pYES2-mt的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

以載體 pUC57-mt為模版，設(shè)計上游引物UINV:5’-ATCGGGATCCACGATGGACCCAAACTG CTCCTGCG-3’， 下 游 引 物 DINV:5’-CGATCTCGAGTCAAGCACAGCAAGAGCACTTTTCT GATG-3’PCR擴增mt基因。擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并切膠回收?；厥债a(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I雙酶切，加入經(jīng)相同酶切的載體pYES2，16℃過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，并全部涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。隨機挑取大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，菌落PCR鑒定，獲得重組載體pYES2-mt。

將釀酒酵母INVSC1菌株接種至YPD液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜。制備酵母感受態(tài)細胞，并用醋酸鋰介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，將表達載體pYES2-mt轉(zhuǎn)化到酵母細胞中(Gietz et al.，2007)，用含有2%葡萄糖的基本培養(yǎng)基(SC-U-G)篩選轉(zhuǎn)化子。隨機挑取釀酒酵母轉(zhuǎn)化子，菌落PCR鑒定，獲得重組釀酒酵母INVSC1-mt菌株。

1.2.3 酵母細胞吸附材料的制備

將重組酵母菌株INVSC1-mt接種至SC-U-G液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜。離心收集細胞，并用無菌水清洗。將清洗過的細胞接種至含有2%半乳糖的基本培養(yǎng)基(SC-U-β)中，使OD600為0.4。30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)36 h后，收集并清洗細胞，用于Pb2+的吸附實驗。

1.2.4 酵母細胞對Pb2+吸附量的測定

在100 mL的三角瓶中加入30 mL 100 mg·L－1的Pb(NO3)2溶液，加入濕重1 g的酵母細胞，在30℃，150 rpm條件下震蕩培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后10，20，30，60，90和120 min取樣，樣品經(jīng)離心沉淀細胞，原子吸收法測定上清液中的Pb2+濃度。實驗設(shè)野生型酵母細胞INVSC1為對照。Pb2+的吸附量與吸附率按下式計算:

式中:Q為吸附量(mg/g);V為溶液體積(L);C為Pb2+溶液平衡濃度(mg/L);C0為Pb2+溶液初始濃度(mg/L);M為吸附劑質(zhì)量(g);R為吸附率(%)。

2 實驗結(jié)果

2.1 表達載體pYES2-mt的構(gòu)建

以UINV和DINV為引物，以載體pUC57-mt為模板，PCR擴增mt基因，凝膠電泳結(jié)果顯示(如圖1)，擴增得到一條大小約為200 bp的片段，無非特異性條帶產(chǎn)生，該片段與預(yù)期片段大小相符。載體pYES2和mt基因分別經(jīng)雙酶切、連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，37℃培養(yǎng)后，每個平板獲得大約300～500個抗性菌落。

隨機挑取7個大腸桿菌抗性菌落，菌落PCR反應(yīng)鑒定重組載體pYES2-mt，結(jié)果如圖2所示，其中泳道6有特異性條帶產(chǎn)生，大小約為200 bp，與mt基因大小相符，初步鑒定為陽性菌落。本實驗得到的陽性菌落比例較小，考慮可能為載體雙酶切產(chǎn)物中含有大量單酶切片段，經(jīng)連接酶連接后重新環(huán)化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后長成抗性菌落。對泳道6對應(yīng)的大腸桿菌中的目的片段進行DNA測序，測序結(jié)果表明，mt基因已連接入載體pYES2中。mt基因序列正確，在PCR擴增的過程中無突變發(fā)生，重組載體pYES2-mt可用于表達研究。

2.2 釀酒酵母細胞的轉(zhuǎn)化

用醋酸鋰法將表達載體pYES2-mt轉(zhuǎn)化到新鮮制備的酵母感受態(tài)細胞中。培養(yǎng)36 h后，在1 μg質(zhì)粒、100 μg單鏈載運 DNA 及 700 μL 1 ×LiAc/40%PEG-3350/1×TE存在的條件下，100 μL釀酒酵母INVSC1感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化率為2×105/μg DNA。

圖1 以質(zhì)粒pUC57-mt為模板的擴增產(chǎn)物Fig.1 DNA products amplified with pUC57-mt as template

圖2 大腸桿菌E.coli pYES2-mt菌落PCR鑒定Fig.2 Colony PCR results of mt gene in strain E.coli(pYES2-mt)

隨機挑取釀酒酵母轉(zhuǎn)化子單菌落，菌落PCR反應(yīng)鑒定陽性菌株。電泳結(jié)果顯示(圖3)，泳道3有一條大小約200 bp的目的片段，表明相應(yīng)的酵母菌株為陽性轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化了mt基因的釀酒酵母菌株記為S.cerevisiae INVSC1-mt。

2.3 釀酒酵母INVSC1-mt菌株對Pb2+的生物吸附

以野生型菌株為對照，初步測定了表達金屬硫蛋白的釀酒酵母INVSC1-mt菌株對Pb2+的吸附作用。結(jié)果表明(圖4)，在濃度為100 mg/L的Pb2+溶液中，兩種細胞的吸附量均達到了4 mg/g濕重細胞以上，吸附效果顯著。隨著吸附時間的增加，無論是野生型菌株，還是表達了MT的工程菌株，Pb2+的吸附量和吸附率均逐漸增大，在10 min時，吸附率分別為78.35%和85.88%，120 min時，吸附率達到了90.44%和96.81%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，表達了MT的釀酒酵母INVSC1-mt菌株對Pb2+的吸附量明顯高于野生型菌株，尤為值得注意的是，釀酒酵母INVSC1-mt菌株吸附Pb2+的速度較快，在30 min時，其吸附率就達到了96.03%，吸附量為5.76 mg/g濕重細胞，而在30～120 min，吸附率沒有顯著的增加。相比之下，野生型菌株在30 min時，吸附率遠低于INVSC1-mt菌株，為86.48%，至120 min，其吸附率才達到90.44%。

3 結(jié)論

在多種微生物、動物和植物細胞內(nèi)普遍存在對金屬離子具有親和能力的蛋白質(zhì)，稱為金屬結(jié)合蛋白，它們可與環(huán)境中的金屬離子通過化學結(jié)合作用形成復(fù)合物而降低，消除金屬離子對生物細胞的毒性，進而提高金屬離子的胞內(nèi)積累。目前研究的金屬結(jié)合蛋白主要為天然存在的結(jié)合蛋白，如金屬硫蛋白、金屬硫蛋白樣蛋白、植物螯合素、金屬抗性調(diào)控蛋白，以及生物體含金屬酶和金屬轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)域的模擬物以及金屬結(jié)合肽的模體等(Kazumasa et al.，2005;Kao et al.，2008;Kotrba et al.，2010;Mehran，2008)。

圖3 釀酒酵母S.cerevisiae INVSC1-mt轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.3 Colony PCR results of strain S.cerevisiae INVSC1-mt

圖4 表達MT的重組釀酒酵母INVSC1-mt菌株對Pb2+的吸附作用Fig.4 Biosorption capacity and rate of Pb2+by recombinant strain S.cerevisiae INVSC1-mt

本研究通過改造并合成人源金屬硫蛋白基因，并將該基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母細胞內(nèi)進行了高效表達，同時研究了工程菌對Pb2+的吸附作用。研究結(jié)果表明，金屬硫蛋白基因的表達有助于提高釀酒酵母細胞對Pb2+的吸附作用，其最大吸附量比野生型菌株提高了11%。尤為重要的是，工程菌吸附Pb2+的速度明顯加快，在30 min內(nèi)對Pb2+的吸附率即達到了96.03%，這在實際應(yīng)用中將大大縮短微生物對廢水的處理時間，有利于提高處理效率，具有潛在的應(yīng)用價值。本研究結(jié)果進一步確證了，應(yīng)用基因工程技術(shù)在微生物細胞內(nèi)大量合成金屬結(jié)合蛋白，通過細胞的新陳代謝作用，將金屬離子轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)與相關(guān)蛋白螯合結(jié)晶，是提高微生物吸附重金屬離子的一條有效途徑。

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