徐捷

延胡索為多年生草本植物，含有多種生物堿，具有活血化瘀、行氣止痛的功能。對(duì)于治療胸悶痹痛、跌打損傷、血瘀痛經(jīng)有奇效［1］。其生物堿主要有延胡索甲素(d-corydaline)、延胡索乙素(d1-Tetrahydropalmatine)、延胡索丙素(protopine)，大多以生物堿鹽結(jié)合態(tài)形式存在［2］。臨床上多用炮制后的延胡索，《中國藥典》2005版詳細(xì)介紹了延胡索凈制法、醋炙法和醋煮法三種方法［3］，結(jié)果證實(shí)，酒制延胡索能夠增強(qiáng)活血化瘀的活性，醋制延胡索可以提高行血止痛的療效［4］。本文以延胡索中主要有效成份延胡索乙素為研究對(duì)象，采用高效液相色譜法(HPLC)，探討不同炮制方法對(duì)延胡索乙素的影響，旨在為優(yōu)化炮制方法及制定飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 延胡索來源于天津中新藥業(yè)藥材公司(批號(hào)：070912);參照品延胡索乙素(批號(hào)：20022007)從中國食品藥品生物制品檢驗(yàn)所獲取;色譜醇選用甲醇;黃酒選用浙江紹興黃酒;陳醋選用北京陳醋廠生產(chǎn)的;實(shí)驗(yàn)用水為自制雙蒸水;其它試劑均為分析醇。色譜系統(tǒng)為美國Water-717，包括高效色譜分析儀、紫外檢測(cè)器、色譜工作站;烘箱選用湖北黃石醫(yī)療器械廠(HDG78-1);電子天平選用美國梅特勒天平公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備：根據(jù)中藥炮制規(guī)范［5］，對(duì)延胡索進(jìn)行醋煮、醋烘、醋炙、酒炙等炮制。①醋煮延胡索：取適量延胡索，用20%醋予以伴潤(rùn)，醋液被完全吸收后，加入自制雙蒸水把藥面淹沒，先用武火煮沸，隨后用文火煎煮，直至醋溶液被吸盡為止，干燥留置備用;②醋烘延胡索：取適量延胡索，加入20%醋使其浸潤(rùn)，待醋被延胡索吸盡后，取出置入烘箱內(nèi)，溫度調(diào)到120℃，將浸潤(rùn)后的延胡索烘烤45 min，然后取出晾干備用;③醋炙延胡索：取適量延胡索，加入20%醋使其浸潤(rùn)，待延胡索充分吸盡醋液后，以文火炒干備用;④酒炙延胡索：取適量延胡索，加入20%紹興黃酒使其浸潤(rùn)，延胡索完全吸盡黃酒后，用文火將其炒干備用。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備：精確稱量延胡索乙素對(duì)照品2.257 mg，置于10 ml量瓶中，加入甲醇至刻度線，配制延胡索對(duì)照溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備：精確稱量醋煮、醋烘、醋炙、酒炙延胡索及生品延胡索各5 g，40目篩濾過，分別置于標(biāo)準(zhǔn)三角瓶中，加自制雙蒸水100 ml，超聲提取25 min，取上層清液;重復(fù)上述步驟1次，合并二次濾液;加入50 ml水到殘?jiān)?，待溶解后加?0 ml濃氨水，用乙醚萃取3次，提取萃取液，水浴55℃蒸干，取0.2 g濃縮物，用2 ml甲醇溶解，置入冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 色譜條件：選擇美國安杰倫公司色譜柱AgilentTC-C18(250 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相選擇甲醇-0.1%磷酸溶液(甲醇∶0.1%磷酸溶液 =28∶72)pH值范圍5.2～5.4，流速1.0 ml/min;色譜柱溫為35℃，波長(zhǎng)為280 nm;同時(shí)要求根據(jù)延胡索乙素峰計(jì)算出的塔板數(shù)理論值不低于3 000。此時(shí)測(cè)得延胡索乙素對(duì)照品色譜、延胡索樣品色譜見圖1、2。

圖1 延胡索乙素對(duì)照品色譜

圖2 延胡索樣品色譜

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn) 分別吸取延胡索乙素對(duì)照品溶液0.19、0.28、0.37、0.46、0.55、0.64、0.73 ml，置入甲醇定容置 2 ml瓶中，配制成不同濃度的延胡素溶液，取上述溶液各20μl，做HPLC分析。以延胡索含量(μg)對(duì)應(yīng)色譜峰面積進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為：Y=2.412×105X-6.14×104，相關(guān)系數(shù)γ=0.995，線性范圍0.19～1.36μg呈現(xiàn)相關(guān)性。

2.2 精密度試驗(yàn) 取同一供品溶液，每次20μl，重復(fù)進(jìn)樣5次，在同樣的色譜條件進(jìn)行延胡索乙素測(cè)定，將測(cè)定數(shù)值代入回歸方程，RSD=0.18%，說明本次試驗(yàn)方法有良好的精密度。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供品溶液，采取0.2、4、6、8、10每隔2 h進(jìn)樣的方式，每次進(jìn)樣2 020μl，測(cè)定溶液中延胡索乙素含量，此時(shí)延胡索乙素峰面積RSD為1.875%，表明在10 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性能良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品，制備成5份供試品溶液，在相同的色譜條件下測(cè)定延胡索乙素的含量，測(cè)定結(jié)果RSD為1.74%，表明本試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn) 選取5份已知含量的樣品，把1 ml的延胡索乙素對(duì)照品溶液(0.19 mg/ml)加入到5份樣品中，按供試品溶液制備方法制備溶液，根據(jù)色譜含量測(cè)定方法測(cè)定其含量，并計(jì)算加樣回收率。見表1。

表1 延胡索乙素加樣回收率計(jì)算結(jié)果

2.6 樣品含量測(cè)定 分別取延胡索生品、延胡索醋烘品、延胡索醋煮品、延胡索醋炙品、延胡索酒炙品試品溶液，在色譜分離條件下測(cè)定其峰面積，計(jì)算延胡索乙素含量。見表2。

表2 5種供試品中延胡索乙素含量測(cè)定結(jié)果n=3，mg/g

3 討論

關(guān)于延胡索不同炮制方法對(duì)延胡索乙素影響的研究，文獻(xiàn)報(bào)道很多，曹柳等［6］曾用醋炙、醋煮、酒炙的方法炮制延胡索，發(fā)現(xiàn)醋炙、酒炙二種炮制方法都比延胡索生品中延胡索乙素含量高，而醋煮炮制方法延胡索乙素比生品含量偏低;本文研究也證實(shí)，醋烘延胡索、醋炙延胡索、酒炙延胡索所測(cè)定的延胡索乙素比延胡索生品中高，而醋煮延胡索比延胡索生品延胡索乙素低。這可能是由于延胡索中生物堿大多表現(xiàn)為游離態(tài)的形式，而游離態(tài)生物堿難深于水，經(jīng)過醋制或酒制后，形成生物堿鹽而增加溶解度。王光寧等［7］通過試驗(yàn)也證實(shí)，經(jīng)過醋制的延胡索乙素煎出率比生品延胡索高出20%左右。

傳統(tǒng)的延胡索炮制方法有醋炒、醋蒸、醋煮、灑炙等，延胡索經(jīng)醋炙、酒炙后，通改變延胡索的組織結(jié)構(gòu)，有利于其有效成分的浸潤(rùn)、溶解、擴(kuò)散與轉(zhuǎn)化，提高延胡索乙素的溶出率［8］。醋煮炮制方法使延胡索中乙素下降的原因可能是由于與煮的時(shí)間過長(zhǎng)，破壞了其生物堿結(jié)構(gòu)。

延胡索是臨床上常用的中藥材，大多以炮制品入藥，由于各地炮制方法存在差異，因此優(yōu)化炮制方法就顯得尤為重要，本文采用超聲的方法提取不同炮制品中的延胡索乙素，方法操作簡(jiǎn)單，提取比較完全，穩(wěn)定性良好，精密度高，適用于延胡索炮制品的質(zhì)量控制。

1 肖崇原主編.中藥化學(xué).第1版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1997.59.

2 沈志沖.元胡不同炮制方法對(duì)延胡索乙素含量的影響.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，38：4454-4458.

3 國家藥典委員會(huì)編.中華人民工共和國藥典.第1版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.94.

4 竇志英，孫巍，田麗莉，等.HPLC法比較延胡索生品與不同炮制品中3 種有效成份的含量.中藥材，2007，30：399-401.

5 浙江省食品藥品監(jiān)督管理局主編.浙江省中藥炮制規(guī)范.第1版.杭州：浙江科技出版社，2005.48-49.

6 曹柳，竇志英，王萍，等.不同炮制方法對(duì)延胡索中有效成分含量的影響.中國中醫(yī)藥信息雜志，2009，16：42-44.

7 王光寧，李勇.炮制延胡索對(duì)延胡索乙素和去氫紫堿含量的影響.食品與藥品，2007，9：1-2.

8 馮自立，周建軍，張濤，等.高效液相法測(cè)定陜西產(chǎn)延胡索中延胡索乙素、原阿片堿的含量.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37：9832-9840.