汪 云 ， 王利群 ，2，何玉財(cái) ，2，朱 劼 ，卿 青 ，王明慧

（1常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 常州 213164；2常州市藥品制造與質(zhì)量控制工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常州 213164）

（R）-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯[(R)-HPBE]是合成眾多普利類系列血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）類抗高血壓和充血性心力衰竭藥的關(guān)鍵手性中間體[1]，其制備方法主要有化學(xué)法和生物法[2-7]。其中利用生物催化劑直接對(duì)前手性酮進(jìn)行不對(duì)稱還原，理論上可將前體100%轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物，是目前高效合成(R)-HPBE的最有效方法之一。

目前，已有不少研究者報(bào)道了通過(guò)篩選微生物菌株不對(duì)稱還原 2-氧代-4-苯基丁酸乙酯合成(R)-HPBE，何春茂等[5]篩選出一株對(duì)OPBE具有良好還原能力的菌株Bacillus pumilusPhe-C3，在 25 mmol/L的底物濃度下產(chǎn)率達(dá)74.5%，e.e.值達(dá)97%。Zhang等[2]以Candida kruseiSW2026為催化劑，在底物濃度為12 mmol/L時(shí)，獲得的產(chǎn)率和e.e.值分別為 95.1%和 99.7%。由于底物和產(chǎn)物在水中溶解度較低，同時(shí)高濃度的底物和產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性，因此在水相中微生物對(duì)OPBE的催化還原僅能在低濃度下進(jìn)行，難以達(dá)到滿意的催化效果。Shi等[6]用面包酵母為催化劑，研究了在水/苯兩相體系中催化OPBE制備(R)-HPBE，產(chǎn)率和e.e.值分別達(dá)到67.1%和96.2%。汪慶等[7]采用固定化細(xì)胞催化拆分得到(R)-HPBE，連續(xù)轉(zhuǎn)化 12次后細(xì)胞活性未明顯下降。

因此，篩選出具有高立體選擇性還原OPBE微生物菌株及建立合適的生物催化反應(yīng)體系對(duì)于高效合成高光學(xué)純(R)-HPBE有著重要的意義。本研究從土壤中篩選出一株對(duì)OPBE具有更高催化活性和立體選擇性還原酶微生物菌株，通過(guò)將細(xì)胞進(jìn)行固定化并在水/有機(jī)溶劑兩相體系中不對(duì)稱還原 OPBE合成(R)-HPBE，為生物催化合成(R)-HPBE工業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀，手性柱 OD-H柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），日本 Daicel公司；GC-950氣相色譜儀，上海海欣色譜儀器有限公司；R2ID旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義市予化儀器制造有限公司；THZ-072 HT恒溫?fù)u床，上海博彩生物科技有限公司。

2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，純度＞99%，常州武進(jìn)精細(xì)化工有限公司；(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯，色譜純，Sigma公司；海藻酸鈉，CP，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)色譜純或分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）富集培養(yǎng)基M1 (g/L) 葡萄糖 1.0，酵母膏 5.0，K2HPO41.0，KH2PO41.0，OPBE 4.0，pH值為7.0。

（2）平板初篩培養(yǎng)基M2 (g/L) 酵母膏 3.0，(NH4)2SO45.0，K2HPO41.0，KH2PO41.0，MgSO40.1，瓊脂20，OPBE 4.0，pH值為7.0。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基M3 (g/L) 葡萄糖 20，蛋白胨 10，酵母膏 10，(NH4)2SO42.0，MgSO41.0，K2HPO41.0，KH2PO41.0，pH值為7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

（1）富集培養(yǎng) 取20 g土壤于50 mL無(wú)菌水中，搖勻，靜置一段時(shí)間，取2 mL于50 mL的富集培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，如此轉(zhuǎn)接2次。

（2）平板初篩 將上述菌液稀釋105倍后均勻涂布到含一定濃度的OPBE的初篩培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)2～3天。

（3）發(fā)酵培養(yǎng) 將上述平板上長(zhǎng)出的單菌落活化后保種，并接到 M3的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)72 h。

（4）催化反應(yīng) 將培養(yǎng)好的菌體于4 ℃、8000 r/min離心 10 min，棄上清液，菌體用 PBS（0.1 mol/L，pH =7.0）洗滌兩次后進(jìn)行催化反應(yīng)。反應(yīng)體系包括PBS 5 mL，菌體0.2 g，底物20 mmol/L。

1.2.2 目標(biāo)菌株的培養(yǎng)

將篩選到的目標(biāo)菌株發(fā)酵液按5% （體積比）的接種量接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)72 h。8000 r/min，4 ℃離心10 min收集菌體，0.9%生理鹽水洗滌3次，用于后續(xù)的固定化。

1.2.3 細(xì)胞固定化方法

將收集的菌體稱取20.0 g懸浮于100 mL的生理鹽水中，攪拌均勻。再加入等體積的 3%海藻酸鈉，充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆?。?#注射器吸取上述混合液滴入到2%的CaCl2溶液中，得到直徑為3 mm左右的紅色球狀固定化細(xì)胞，鈣化2 h后收集固定化細(xì)胞，用生理鹽水洗凈，4 ℃冰箱冷藏備用。1 g濕菌體可得4.5 g固定化細(xì)胞（瀝干）。

1.2.4 兩相體系中生物催化還原反應(yīng)

在 50 mL具塞三角瓶中加入不同體積的 20 mmol/L的Tris-HCl（pH=7.5）緩沖液和有機(jī)溶劑（兩相總體積為20 mL），再加入一定量的OPBE，然后加入一定量的固定化細(xì)胞和一定量的輔底物，置于搖床中30 ℃，180 r/min下轉(zhuǎn)化一定時(shí)間。4 ℃下8000 r/min離心10 min，取出上層有機(jī)相，下層水相用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，分析產(chǎn)物的產(chǎn)率和對(duì)映體過(guò)量值（e.e.）。在固定化細(xì)胞重復(fù)利用實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)結(jié)束后用生理鹽水洗滌固定化細(xì)胞3次，濾紙吸干表面水分后用于下一批次轉(zhuǎn)化。

1.2.5 分析方法

（1）產(chǎn)率測(cè)定 采用氣相色譜檢測(cè)，以十二烷為內(nèi)標(biāo)物的內(nèi)標(biāo)法定量。色譜柱為毛細(xì)管柱（25 m×0.25 mm×0.25 μm）。氣相色譜條件：載氣為H2，流量為2.0 mL/min，分流比1∶50，氣化溫度和檢測(cè)溫度均為 250 ℃，柱溫 160 ℃保留 1.5 min，以10 ℃/min 升溫至230 ℃維持10 min。

（2）e.e.值測(cè)定 采用帶手性柱的高效液相色譜法。流動(dòng)相正己烷∶異丙醇=95∶5；流速 1 mL/min；柱溫20 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm。

產(chǎn)物的產(chǎn)率（Yield）和對(duì)映體過(guò)量值（e.e.）計(jì)算式如式（1）、式（2）。

式中，Ci為底物OPBE 的初始摩爾濃度；CHPBE為反應(yīng)終止時(shí)產(chǎn)物摩爾濃度；AR和AS分別表示R型和S型產(chǎn)物的峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 高選擇性目標(biāo)菌株的篩選結(jié)果

從200份土壤中利用富集培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行篩選，獲得1株編號(hào)G5的微生物菌株能夠高立體選擇性不對(duì)稱催化還原 20 mmol/L OPBE合成(R)-HPBE（產(chǎn)率76.3%，e.e.值99.2%）。經(jīng)上海生工生物有限公司測(cè)序鑒定該菌為黏紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，命名為Rhodotorula mucilaginosaCCZU-G5。

2.2 有機(jī)溶劑的篩選

有機(jī)溶劑的存在可以提高轉(zhuǎn)化體系中底物和產(chǎn)物的溶解度[8]，進(jìn)而提高產(chǎn)物的產(chǎn)率。實(shí)驗(yàn)考察了OPBE濃度為100 mmol/L轉(zhuǎn)化體系中不同lgP值有機(jī)溶劑（Vaq/Vorg=1/1）對(duì)還原反應(yīng)的影響，結(jié)果如表1所示。在lgP值較小的乙酸乙酯、苯、甲苯與水組成的兩相體系中轉(zhuǎn)化24 h，無(wú)產(chǎn)物生成，這可能是由于這些有機(jī)溶劑對(duì)固定化酵母細(xì)胞毒性或抑制作用較大。而在lgP值較大的壬烷和癸烷與水組成的兩相體系中，產(chǎn)率也只能達(dá)到65%，這可能是因?yàn)榈孜颫PBE在二者中溶解度（數(shù)據(jù)未給出）較低造成。很明顯，在水/異辛烷兩相體系中產(chǎn)物的產(chǎn)率最高，達(dá)72.1%，e.e.值＞99.0%。綜合考慮產(chǎn)物產(chǎn)率和e.e.值，選用水/異辛烷兩相體系為最適的反應(yīng)體系用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

表1 不同有機(jī)溶劑的兩相體系中固定化酵母不對(duì)稱還原OPBE的情況

2.3 最適反應(yīng)時(shí)間

兩相體系中不對(duì)稱還原的反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)的產(chǎn)率和 e.e.值影響很大，實(shí)驗(yàn)首先測(cè)定了在底物濃度為100 mmol/L，異辛烷比例為50%的水/有機(jī)溶劑轉(zhuǎn)化體系中反應(yīng)時(shí)間對(duì)還原反應(yīng)的影響，如圖 1所示。在水/異辛烷兩相體系中固定化酵母細(xì)胞還原OPBE隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)率和e.e.值都逐漸提高，轉(zhuǎn)化16 h產(chǎn)率和e.e.都維持不變，分別為74.1%和99.5%。因此，最適反應(yīng)時(shí)間為16 h。

2.4 有機(jī)溶劑比例對(duì)還原反應(yīng)的影響

兩相反應(yīng)體系中，提高有機(jī)溶劑的比例，底物和產(chǎn)物的溶解度增大，產(chǎn)率也隨之提高，但由于有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的毒害作用，有機(jī)溶劑比例過(guò)高也會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)率下降[9-10]。本研究進(jìn)一步考察了不同體積比（5%～60%）異辛烷對(duì)轉(zhuǎn)化(R)-HPBE的影響，結(jié)果如圖2所示，當(dāng)異辛烷含量為10%時(shí)，產(chǎn)物的產(chǎn)率較高，為83.2%，繼續(xù)提高有機(jī)溶劑比例，產(chǎn)率下降，有機(jī)溶劑的比例對(duì)反應(yīng)的 e.e.值無(wú)明顯影響。這與Reku?等[11]闡述的結(jié)果一致。故本實(shí)驗(yàn)選擇 10%異辛烷作為水/有機(jī)溶劑兩相反應(yīng)體系進(jìn)行后續(xù)研究。

2.5 不同輔底物對(duì)還原反應(yīng)的影響

絕大多數(shù)全細(xì)胞的不對(duì)稱催化需要有輔酶再生體系與還原反應(yīng)耦合，以維持反應(yīng)的進(jìn)行[10]。不同的輔底物對(duì)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的效果不同。在底物濃度為100 mmol/L，10%異辛烷的水/有機(jī)溶劑兩相體系中，以未添加輔助底物為對(duì)照，考察了添加6種不同輔底物（乙醇、異丙醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖）對(duì)還原反應(yīng)的影響（表2）。由表2可知，不同的輔助底物對(duì)反應(yīng)的影響較大。其中添加葡萄糖作為輔底物時(shí)，產(chǎn)率達(dá)到最大。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了10～70 g/L的不同葡萄糖濃度對(duì)還原反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖3所示，隨著葡萄糖濃度的增加，產(chǎn)率逐漸上升；當(dāng)葡萄糖含量達(dá)到40 g/L時(shí)，產(chǎn)率達(dá)到最高，繼續(xù)增大葡萄糖的濃度，產(chǎn)率沒(méi)有明顯提高，而葡萄糖濃度對(duì)整個(gè)反應(yīng)的e.e.值影響不大，均保持在 99%以上。綜合考慮成本與來(lái)源因素，選擇 40 g/L 葡萄糖輔作為輔底物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究。

2.6 初始底物濃度對(duì)還原反應(yīng)的影響

對(duì)于生物催化而言，反應(yīng)體系中不同初始濃度的底物對(duì)微生物催化的不對(duì)稱還原反應(yīng)有一定影響[12]。本研究考察了不同初始OPBE濃度（50～200 mmol/L）對(duì)還原反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖4所示。在兩相體系中反應(yīng)16 h，底物濃度對(duì)產(chǎn)物的e.e.值影響不大。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0 mmol/L時(shí)，產(chǎn)率為96.5%。隨著底物濃度的增加，產(chǎn)物的產(chǎn)率逐漸降低，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00 mmol/L和200 mmol/L時(shí)，產(chǎn)率分別為 83.3%和 44.0%，這說(shuō)明底物對(duì)生物催化劑有一定的抑制作用。然而，Rhodotorula mucilaginosaCCZU-G5 催化活性明顯比文獻(xiàn)[2，5-6，13]報(bào)道的結(jié)果要高，可見固定化黏紅酵母在合成(R)-HPBE中有著潛在的應(yīng)用前景。

表2 不同輔助底物對(duì)OPBE不對(duì)稱還原(R)-HPBE反應(yīng)的影響

2.7 固定化催化劑用量對(duì)還原反應(yīng)的影響

生物催化體系中，催化劑用量對(duì)還原反應(yīng)有直接影響[14]。本研究分別考察了在100 mmol/L的底物濃度下不同用量的固定化細(xì)胞（0.2～0.5 g/mL）對(duì)還原反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，隨著催化劑用量的增加，產(chǎn)物的產(chǎn)率增加，在0.45 g/mL固定化酵母細(xì)胞作用下產(chǎn)率達(dá)到83.5%，繼續(xù)提高催化劑用量產(chǎn)率不再增加。固定化細(xì)胞用量的改變對(duì) e.e.值影響不大，維持在 99%以上。因此，固定化細(xì)胞最適添加量為0.45 g/mL。

2.8 固定化細(xì)胞重復(fù)利用次數(shù)對(duì)還原反應(yīng)的影響

在優(yōu)化上述反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，考察 100 mmol/L底物濃度下固定化細(xì)胞重復(fù)利用次數(shù)對(duì)于還原反應(yīng)的影響。為了維持固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度，在多批次轉(zhuǎn)化過(guò)程中加入0.05%的CaCl2（未加時(shí)固定化細(xì)胞有明顯的吸脹），結(jié)果見圖6。從圖6可知，固定化細(xì)胞穩(wěn)定性較好，隨著轉(zhuǎn)化次數(shù)的增多，產(chǎn)率下降的幅度較小，在第7個(gè)周期后產(chǎn)率還維持在70%以上，至第8個(gè)周期開始顯著下降。固定化細(xì)胞的重復(fù)利用對(duì)產(chǎn)物的 e.e.值影響不大，均維持在99%以上，說(shuō)明固定化細(xì)胞穩(wěn)定性較好。

3 結(jié) 論

從土樣中篩選得到一株能高效催化OPBE不對(duì)稱還原合成(R)-HPBE的菌株，并鑒定為黏紅酵母，通過(guò)將細(xì)胞進(jìn)行固定化并在水/有機(jī)溶劑兩相體系中不對(duì)稱還原OPBE合成(R)-HPBE，研究得到以下結(jié)論。

（1）不同的有機(jī)溶劑對(duì)還原反應(yīng)有著顯著的影響，lgP在3.5以上的有機(jī)溶中，用水/異辛烷組成的兩相體系可以獲得較好的催化效果。

（2）兩相體系中有機(jī)溶劑的比例、初始底物濃度、輔助底物的種類和濃度以及催化劑用量對(duì)還原反應(yīng)也有顯著的影響，當(dāng)初始底物濃度為 100 mmol/L，在含10%異辛烷、輔底物葡萄糖40 g/L、催化劑用量0.45 g/mL的兩相體系中反應(yīng)16 h，產(chǎn)率為83%。另外，上述條件對(duì)反應(yīng)的e.e.值影響不大，均維持在 99%以上。這比之前報(bào)道的所有在單水相和兩相體系中所獲得的產(chǎn)率和光學(xué)純度都要高。

（3）兩相體系中固定化細(xì)胞可重復(fù) 7次，產(chǎn)率和e.e.值都維持在較高水平，穩(wěn)定性較好。

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