乳酸菌及其代謝產物對刺參幼體腸道菌群和非特異性免疫的影響

宮 魁, 王寶杰, 劉 梅, 蔣克勇, 邱楚雯, , 駱作勇, , 范瑞用,王 雷

(1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院 研究生院, 北京 100049; 3. 青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司, 山東 青島 266400)

刺參(Apostichopus japonicus)屬棘皮動物門(Echinodermata), 海參綱(Holothuroidea)。目前刺參已成為我國海水養(yǎng)殖業(yè)中產值最高的養(yǎng)殖品種。隨著養(yǎng)殖產業(yè)的迅速發(fā)展, 病害問題日趨突出, 其中以“爛嘴”、“吐臟”、“搖頭”、“化皮”等為主要特征的“刺參腐皮綜合征”頻繁發(fā)生, 不同程度地波及并危害到各主要刺參養(yǎng)殖產區(qū), 每年造成嚴重的經濟損失[1]?？股睾突瘜W藥物在防治水產病害中雖然有其獨特的作用, 但長期使用導致若干副作用, 如病原菌抗藥性, 內源性感染和二重感染, 同時化學藥物在水產動物體內殘留, 直接危害人類健康[2]。因此,減少抗生素及化學藥物的使用, 尋找替代藥劑, 發(fā)展生態(tài)養(yǎng)殖是刺參養(yǎng)殖業(yè)的必由之路。

作為微生態(tài)制劑的主要菌種, 乳酸菌在畜禽業(yè)已被廣泛應用, 其具有無毒副作用、促進動物生長、提高飼料轉化率、可替代抗生素等優(yōu)點。但其在水產養(yǎng)殖中應用較少, 作用機理不明確, 限制了其在水產養(yǎng)殖業(yè)的推廣。本研究通過研究乳酸菌及其代謝產物對刺參腸道菌群、非特異性免疫及特定生長率影響, 初步探索在刺參養(yǎng)殖中的乳酸菌菌體與代謝產物所起益生作用, 以期為乳酸菌制劑在刺參養(yǎng)殖中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 乳酸菌制劑

乳酸菌: 市售商品化菌種(干粉保存), 經分析檢測為屎腸球菌(Enterococcus faecium)與植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)的混合菌種。經實驗室活化后, 小型發(fā)酵罐中試發(fā)酵, 經平板計數(shù)法檢測發(fā)酵液活菌密度為4×109個/mL, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

乳酸菌代謝產物: 將乳酸菌發(fā)酵液置于-20℃冰箱保存48 h , 4℃, 6000 r/min, 30 min, 連續(xù)離心3次。經平板計數(shù)法檢測其剩余乳酸活菌密度約為103個/mL。

1.2 試驗動物

試驗用刺參由青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司提供, 為同一批孵化, 挑選規(guī)格基本一致的健康刺參,初始平均體質量為(2.74 ± 0.17)g。

1.3 方法

1.3.1 試驗管理

試驗于青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司海參育苗場進行。挑選個體規(guī)格一致的健康刺參, 隨機分為3組, 每組5個重復, 分別放入5 m×3 m×1m的養(yǎng)殖池,每池布苗量為 40 kg。按照常規(guī)生產規(guī)程進行管理,連續(xù)充氣, 每天14:00投喂一次餌料, 日投餌量為刺參體質量的5%, 根據攝食、生長及糞便情況隨時調整。每天換水 50%。試驗期間水溫 13～15℃, pH7.83～8.14, 溶解氧5.7～6.8 mg/L。鮮海泥取自青島膠南瑯琊海域, 用量為干飼料質量的 8倍。實驗自 2011年 12月3日開始。對照組飼喂基礎飼料(表1), 乳酸菌實驗組添加 2mL/m3(按水體折算)乳酸菌制劑, 乳酸菌代謝產物組添加2 mL/m3(按水體折算)乳酸菌代謝產物。

表1 基礎飼料搭配比例Tab.1 Composition of experimental basal diets

1.3.2 微生物分析

每組隨機取3頭刺參, 無菌解剖取其腸道, 去除腸道糞便, 無菌生理鹽水充分沖洗后, 置于滅菌的玻璃勻漿器中, 加入適量無菌生理鹽水勻漿, 倍比稀釋,選擇合適的稀釋度取0.1mL, 分別接種2216E平板、麥康凱平板、TCBS平板和MRS平板, 并用無菌玻璃涂布棒涂布均勻, 培養(yǎng)適宜時間后, 進行平板細菌計數(shù)。

1.3.3 免疫指標

每組隨機取 20頭刺參, 解剖取體腔液, 吸取抗凝劑, 與體腔液體積比1:1混勻。所得體腔液, 一部分直接用于體腔細胞計數(shù)、吞噬活性的測定; 另一部分離心10 min(3000r/min, 4℃)后棄上清, 用含0.1 mmol/L苯甲基磺酞氟的 PBS緩沖液將體腔細胞沉淀物重懸,VC130超聲波破碎儀(美國)破碎(22kHz, 15～20s)懸液中的細胞, 4000 r/min, 4℃離心10 min, 所得上清液即為細胞破碎上清液(CLS), CLS用于堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LSZ)活力的測定。上述酶活采用上海生工試劑盒進行測定, 相關操作及計算均按試劑盒說明進行。體腔液細胞的吞噬活性測定參考王斌等[3]方法, 將200μL體腔細胞在96孔板中貼壁30 min后, 棄上清, 每孔加入100 μL中性紅(體積分數(shù)0.1%)吞噬30 min后, PBS緩沖液沖洗3遍, 洗去未被吞噬的中性紅, 加入 200 μL細胞裂解液裂解 20min,全波長酶標儀540 nm處讀取吸光值, 結果以每108個細胞的吸光值來表示吞噬活性的高低。

1.3.4 特定生長率

試驗持續(xù)60 d, 分別在試驗第20天、第40天和第 60天隨機取樣, 分析天平(精確度為 0.001g)稱質量, 測定特定生長率(RSG)。計算公式:

1.3.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據用 spss16.0軟件進行單因素方差(ANOVA)分析, 多重比較采用 LSD法進行。結果以平均值±標準誤(M±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 刺參腸道菌群變化

表2 投飼乳酸菌及其代謝產物后刺參腸道菌群變化(M±SD)Tab.2 The changes of intestinal microflora after using probiotics(M±SD)

連續(xù)投飼20d, 兩實驗組刺參腸道乳酸菌均顯著增多(P＜0.05); 40、60d, 兩實驗組刺參腸道乳酸菌也有一定程度增多。在試驗期間, 兩實驗組大腸桿菌菌落數(shù)均顯著減少(P＜0.05)?；【鲋骋嗍芤欢ㄒ种? 除40d,乳酸菌組弧菌量與對照組差異不顯著外, 兩實驗組弧菌均顯著降低(P＜0.05)。刺參腸道異養(yǎng)菌總數(shù)在第40天差異顯著(P＜0.05), 其余時間差異不明顯(表2)。

2.2 免疫指標

2.2.1 體腔細胞計數(shù)

連續(xù)投飼乳酸菌與乳酸菌代謝產物, 乳酸菌實驗組、代謝產物實驗組和對照組體腔細胞含量差異不顯著, 表明乳酸菌及其代謝產物對刺參體腔細胞數(shù)量影響不明顯(表3)。

表3 乳酸菌與其代謝產物對刺參體腔細胞的影響(M±SD)Tab. 3 The effects of lactic acid bacteria and its metabolites on coelomocyte of Apostichopus japonicus (M±SD)

2.2.2 體腔細胞吞噬活性

連續(xù)投喂乳酸菌及其代謝產物, 刺參體腔細胞吞噬活性明顯上升(P＜0.05)。其中乳酸菌實驗組和代謝產物實驗組體腔細胞吞噬活性在40、60 d差異不顯著(表4)。對照組在20、40、60 d體腔細胞吞噬活性均顯著低于乳酸菌實驗組和代謝產物組(P＜0.05)。

表4 乳酸菌與其代謝產物對刺參體腔細胞吞噬活性的影響(M±SD)Tab. 4 The effects of lactic acid bacteria and its metabolites on phagocytic activity of coelomocyte (M±SD)

2.2.3 體腔細胞免疫酶活性

刺參ACP活性測定結果見圖 1。20、40、60 d活性乳酸菌組、代謝產物組與對照組刺參ACP差異顯著(P＜0.05), 且乳酸菌組與代謝產物實驗組 ACP活性差異均不顯著。表明投喂乳酸菌和乳酸菌代謝產物均可在一定程度上提高刺參體腔細胞ACP活性,且兩者之間差異不顯著。

刺參體腔細胞AKP活性測定結果見圖2。乳酸菌組與代謝產物組, 體腔細胞AKP活性在20、40、60 d差異均不顯著, 而對照組AKP活性顯著低于各實驗組(P＜0.05)。表明乳酸菌、乳酸菌代謝產物在本實驗條件下, 均可顯著提高體腔細胞 AKP活性,且兩者差異不顯著。

圖1 乳酸菌與乳酸菌代謝產物對刺參體腔細胞ACP的影響Fig.1 The effects of lactic acid bacterial and metabolites on ACP of coelomocytes

圖2 乳酸菌與乳酸菌代謝產物對刺參體腔細胞AKP的影響Fig.2 The effects of lactic acid bacterial and metabolites on AKP of coelomocytes

乳酸菌與乳酸菌代謝產物均能促進刺參體腔細胞LSZ活性(圖3)。但在20d, 乳酸菌實驗組與對照組 LSZ活性差異不顯著。40 d, 各實驗組與對照組LSZ差異均不顯著。表明乳酸菌及乳酸菌代謝產物均能促進體腔細胞 LSZ活性, 但作用效果可能受其他因素影響而不穩(wěn)定。

圖3 乳酸菌與乳酸菌代謝產物對刺參體腔細胞LSZ的影響Fig.3 The effects of lactic acid bacterial and metabolites on LSZ of coelomocytes

2.3 特定生長率

乳酸菌和乳酸菌代謝產物連續(xù)投喂稚參, 均可提高刺參特定增長率(表5)。20～40 d, 乳酸菌實驗組RSG顯著高于對照組(P＜0.05); 40～60 d, 乳酸菌代謝產物實驗組刺參RSG顯著高于對照組(P＜0.05)。在試驗期間, 乳酸菌實驗組與乳酸菌代謝產物組刺參RSG未表現(xiàn)出顯著差異。

表5 乳酸菌及其代謝產物對刺參特定生長率的影響(M±SD)Tab.5 The effects of lactic acid bacteria and its metabolites on RSG of Apostichopus japonicus (M±SD)

3 討論

目前針對乳酸菌的研究, 大多關注菌體與代謝產物共同作用效果[1-2,4], 未有分別針對乳酸菌菌體和乳酸菌代謝產物作用效果的研究。本實驗在前人研究基礎上, 將乳酸菌制劑中的菌體分離, 對乳酸菌發(fā)酵產物和乳酸菌制劑作用效果進行比較, 通過對比試驗, 比較乳酸菌制劑與代謝產物各自益生效果, 為揭示乳酸菌作用機理提供參考。雖前處理未能將乳酸菌活菌徹底去除, 但代謝產物中活菌含量遠低于乳酸菌制劑(相差 106倍), 應能通過刺參養(yǎng)殖實驗比較乳酸菌菌體與發(fā)酵代謝產物各自所起益生功能。

動物腸道菌群和腸黏膜結合形成的機械屏障、免疫屏障與生物屏障不僅發(fā)揮著保持機體內環(huán)境穩(wěn)定的作用, 而且能有效防止致病物質的入侵和菌群內毒素的位移, 在維護機體健康方面起著至關重要的作用[4-9]。許禔森研究發(fā)現(xiàn), 在投喂短乳酸桿菌菌液和凍干菌粉后, 草魚腸道的短乳酸桿菌穩(wěn)定定殖,其數(shù)量呈上升趨勢, 弧菌的數(shù)量下降[8]。曾地剛等發(fā)現(xiàn)投喂乳酸桿菌可有效抑制羅非魚腸道病菌的增殖[9]。胡毅等研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加芽孢桿菌顯著降低了凡納濱對蝦腸道和糞便中的弧菌[4]。上述研究多認為, 外源有益菌可定殖于機體腸道, 通過與有害微生物競爭生態(tài)位點, 抑制有害菌繁殖, 進而對腸道微生態(tài)產生有益調節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn), 投喂乳酸菌及其代謝產物均能對刺參腸道菌群產生有益調節(jié), 腸道乳酸菌均有所提高, 與許禔森等人研究結果相同;而有害菌群如大腸桿菌與弧菌增殖均受到顯著抑制,與胡毅等人研究結論一致。但乳酸菌實驗組與代謝產物實驗組兩者差異不顯著, 表明兩者之間應有相同成分起到調節(jié)腸道微生態(tài)的作用。而乳酸菌代謝產物經前處理后, 其活菌菌體顯著減少, 代謝產物大量留存, 表明兩者共有的乳酸菌代謝產物起到了調節(jié)腸道微生態(tài)的主要功能。且實驗所用乳酸菌菌株來源于陸地, 前期研究發(fā)現(xiàn)其并不適于海洋環(huán)境,在刺參養(yǎng)殖環(huán)境下存活率很低(相關結果另文發(fā)表)。本研究中, 作者認為并不是乳酸菌通過腸道定殖,與有害微生物競爭來調節(jié)腸道微生態(tài), 而是乳酸菌代謝產物對刺參腸道菌群起主要調節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌代謝產物中不僅有大量酸性物質, 且通常含有細菌素(bacteriocin)類物質[10-11], 具有較好的抑菌效果。本實驗菌株由植物乳桿菌和屎腸球菌復合。屎腸球菌與植物乳桿菌在發(fā)酵過程中, 同時會產生大量的乙酸、乳酸及大量活性抑菌物質, 這些發(fā)酵產物隨飼料進入刺參消化道后, 降低腸道內的pH和氧化還原電位值 Eh, 使腸道處于酸性環(huán)境, 拮抗病原性細菌, 從而抑制其增殖, 促進乳酸菌等有益菌群的生長, 調節(jié)刺參腸道微生態(tài), 提高刺參抗感染能力。

棘皮動物體腔細胞是棘皮動物的免疫核心成分,其密度在一定程度上反映了棘皮動物機體的免疫應激能力或健康狀況[12]。而細胞吞噬作用在無脊椎動物的抗菌防御中起著非常重要的作用。本實驗發(fā)現(xiàn),投喂乳酸菌制劑及其代謝產物均未對刺參體腔細胞密度產生顯著性影響, 但體腔細胞吞噬活性有所提高。有研究發(fā)現(xiàn), 飼喂鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus), 可以顯著提高羅非魚細胞吞噬活性[13],本實驗與上述研究結果相近。乳酸菌制劑及乳酸菌代謝產物均對體腔細胞吞噬活性有積極影響, 可能與乳酸菌發(fā)酵過程中產生的活性代謝產物促進刺參吞噬細胞活性有關, 具體作用機理還需要進一步實驗予以驗證。

刺參作為低等動物, 其免疫系統(tǒng)不完善, 主要依靠非特異性免疫來提高對病原的抵抗力。ACP、AKP與 LSZ是反映刺參免疫能力的重要指標, 在刺參防御體系中發(fā)揮重要的作用。Gullia等發(fā)現(xiàn)投喂腸道分離芽孢桿菌, 顯著提高對蝦血清酚氧化酶活力[14]。Salinas等[15]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌和乳酸菌對烏頰魚免疫效果具有較好的促進作用。王永勝等[16]用益生菌飼喂凡納濱對蝦時實驗組溶菌酶、堿性磷酸酶、氧化物歧化酶等指標方面均高于對照組。上述對益生菌的研究, 多發(fā)現(xiàn)其能有效促進水產動物非特異性免疫酶活性, 但未揭示菌體還是代謝產物或者二者共同對免疫酶活發(fā)揮作用。本實驗中, 乳酸菌制劑和乳酸菌代謝產物對刺參ACP、AKP和LSZ活性均有顯著促進, 且兩者之間對上述酶活影響差異不顯著, 對刺參免疫酶活作用效果與上述研究一致。本實驗表明, 含乳酸菌活菌的乳酸菌制劑和去乳酸菌菌體的代謝產物之間對刺參免疫酶活影響差異較小, 作為兩者共有的代謝產物, 起到了主要促進刺參免疫酶活性的作用。而本實驗所用乳酸菌菌體對刺參免疫酶活所起作用很小, 或可忽略不計。

實驗采用SGR作為生長指標, 可很好的描述動物當時的生長趨勢。乳酸菌能產生 B族維生素, 包括葉酸、生物素、維生素B6和維生素K等, 能夠直接為宿主提供必需的營養(yǎng)物質, 促進動物生長[17]。有研究認為, 益生菌促生長機理可能與飼喂益生菌后動物機體腸道消化酶活性的提高有關[18]。本實驗中,乳酸菌和代謝產物對刺參RSG均有所提高。表明乳酸菌代謝產物對刺參生長有一定的促進作用。刺參消化道相對比較簡單, 對營養(yǎng)物質的消化體系不完善,通過在飼料中添加適量乳酸菌制劑, 可補充刺參消化體系中的不足, 促進對營養(yǎng)物質的消化吸收利用率, 從而提高刺參RSG, 實驗結果與上述文獻的結論相同。

綜上, 乳酸菌與乳酸菌代謝產物之間對刺參腸道菌群、非特異性免疫與 SGR影響差異較小, 但均顯著優(yōu)于對照組。表明本實驗所采用乳酸菌制劑, 其代謝產物在對刺參的益生影響中發(fā)揮主要作用。需注意的是, 本實驗未能將發(fā)酵液中的乳酸菌活菌徹底去除, 對實驗結論可能有所干擾。探明有益菌菌體與代謝產物之間各自對刺參所起益生作用, 尚需進一步實驗予以驗證。

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