趙麗麗，王普昶，陳 超，馬 林

（1.貴州大學動物科學學院草業(yè)科學系，貴州 貴陽550025；2.貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽550025）

百脈根（Lotuscorniculatus）是豆科百脈根屬多年生草本植物，別名瘠地苜蓿、五葉草。其株型低矮、匍匐，耐熱性強，夏季一般牧草生長不良時，百脈根仍能良好生長，是水土保持和果園生草的理想草種［1－2］。具有營養(yǎng)豐富、莖葉柔軟細嫩多汁、適口性好、皂素含量低、家畜飼用安全等特性，可用于刈割青飼、調(diào)制干草、加工草粉和混合飼料等，被認為是中國溫帶亞熱帶地區(qū)極具發(fā)展?jié)摿Φ膬?yōu)良牧草［3－5］。中國很多地區(qū)曾從國外引種栽培，雖在各地生長良好，但都未在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，優(yōu)良品種缺乏是其主要限制因子之一。我國野生百脈根種質(zhì)資源豐富，廣泛分布于河北、云南、貴州、四川和甘肅等地［1］。但目前針對野生百脈根種質(zhì)資源的評價、篩選研究較少，因此，加大對野生百脈根種質(zhì)資源的評價、篩選可以有效地推進百脈根新品種的培育工作。

高溫是植物生長過程中最常見的逆境因子之一，嚴重影響植物生長及其產(chǎn)量和品質(zhì)［6］，其對植物的危害規(guī)律也一直是學術(shù)界關(guān)注的熱點。植物耐熱性受植物對高溫脅迫的適應(yīng)性及環(huán)境條件的復雜性等多因子影響，屬于多基因控制的數(shù)量性狀［7］，利用個別或少數(shù)指標的簡單比較難以真實地反映植物耐熱性的遺傳本質(zhì)［8－10］。主成分分析能夠在較少損失原有信息的前提下，把多個彼此相關(guān)的指標簡化為少數(shù)幾個相互獨立的綜合指標［11］。隸屬函數(shù)法是根據(jù)模糊數(shù)學原理，利用多個指標隸屬函數(shù)值的累加值，綜合評估植物的耐熱性。將主成分分析與隸屬函數(shù)法相結(jié)合，并綜合考慮各綜合指標的權(quán)重，經(jīng)加權(quán)求和評價植物的耐熱性，既能充分利用各指標間的深層次聯(lián)系，彌補和緩解單個指標或多個指標直接評定的片面性和重復性，又能兼顧各綜合指標的貢獻度，使評價結(jié)果與實際結(jié)果更為接近。該方法在評價植物的耐熱性方面，得到了很多學者的認可［7－11］。百脈根種質(zhì)的適應(yīng)性研究主要集中在抗旱性鑒定方面［12］，耐熱性研究少見報道。為探索百脈根耐熱機制及耐熱指標，評價各種質(zhì)的耐熱性，本研究以正常溫度與高溫脅迫條件下8個百脈根種質(zhì)為研究對象，測定其在高溫脅迫下的6個生理生化指標，應(yīng)用主成分分析、隸屬函數(shù)法，經(jīng)加權(quán)求和綜合評價8個百脈根種質(zhì)的耐熱性，初步篩選出耐熱性強的百脈根種質(zhì)，以期為發(fā)掘優(yōu)良基因、遺傳改良及新品種培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 8份供試百脈根種質(zhì)材料分別是B01、B02、B03、B04、B05、B08、B12和 B18。B01、B02、B03和B04為中國農(nóng)科院草原研究所中期庫收集入庫的野生種質(zhì)材料，分別來源于日本、加拿大、內(nèi)蒙古和貴陽；B05為市售百脈根品種，南方型；B08、B12和B18分別采自貴州省的施秉、威寧和納雍。

1.2 試驗方法

1.2.1 高溫脅迫處理方法 2011年4月將百脈根種子播種于由河沙、蛭石和腐殖質(zhì)土按1∶1∶1混合的花盆中，置于室外進行日常養(yǎng)護，兩個月后置于溫室中進行脅迫試驗，分別設(shè)置22℃（對照）、35℃和45℃處理，每處理設(shè)3次重復。溫室內(nèi)空氣相對濕度80%。在各盆底放置托盤，托盤中放置一定量的水分（水深1.0～1.5cm）補充基質(zhì)水分。脅迫處理6d后，隨機采集植株中部葉片，測定生理生化指標。

1.2.2 生理生化指標測定方法 參照李合生［13］和鄒琦［14］的方法，葉片相對電導率用雷磁DDSJ－308A型電導儀測定；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法測定；游離脯氨酸（Pro）含量采用酸性茚三酮法測定；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）的活性分別采用NBT光化還原法、愈創(chuàng)木酚氧化法和紫外分光光度法測定［15］。以上測定均重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 運用SPSS 17.0軟件和Excel 2007對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析（ANOVA，P＜0.05），主成分分析［16］和隸屬函數(shù)計算。

1.3.1 隸屬函數(shù)分析 試驗材料各主成分的隸屬函數(shù)值按公式（1）［11］求得。

式中，U（xi）為各種質(zhì)第i個主成分的隸屬函數(shù)值，xi為各種質(zhì)某一主成分得分值，ximax和ximin分別為所有參試種質(zhì)中第i個主成分的最大值和最小值。

1.3.2 權(quán)重 根據(jù)主成分的貢獻率的大小按公式（2）［9］計算各主成分的權(quán)重。

式中，Wi表示第i個主成分在所有主成分中的重要程度；pi為各種質(zhì)第i個主成分的貢獻率。

1.3.3 綜合評價值 高溫脅迫下各試驗種質(zhì)耐熱性用主成分評價所得的耐熱性綜合評分值D值表示，按公式（3）［9］計算可得。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對百脈根生理生化指標的影響 在22℃下，8份百脈根種質(zhì)相對電導率、MDA、Pro含量以及SOD、POD和CAT活性間均無顯著差異，隨處理溫度的增加，各指標發(fā)生了變化，種質(zhì)間出現(xiàn)差異（圖1）。

隨處理溫度的增加，各百脈根種質(zhì)的葉片相對電導率和MDA含量明顯上升。在35和45℃，種質(zhì)B04、B08的相對電導率和MDA含量分別最小，在45℃下，B02的相對電導率最大。在35℃高溫處理下，種質(zhì)B02和B18的MDA含量最大，但升到45℃時，B03的MDA含量迅速增加，成為MDA含量最大的種質(zhì)材料。

在高溫脅迫下，各百脈根種質(zhì)Pro含量均有增大趨勢，且隨著脅迫溫度的上升而明顯增加。在45℃處理下，各種質(zhì)Pro含量均為22℃的7倍以上。此時，種質(zhì)B08和B05的Pro含量顯著高于其他種質(zhì)（P＜0.05）；種質(zhì)B03和B18的Pro含量較小，與其他種質(zhì)差異顯著（P＜0.05）。

隨處理溫度的增加，各百脈根種質(zhì)SOD酶活性均呈先升高后降低趨勢。在35℃下，種質(zhì)B08和B05的SOD活性顯著高于除B04之外的其他種質(zhì)，B03的活性顯著低于除B02之外的其他種質(zhì)（P＜0.05）。當處理溫度升高到45℃時，種質(zhì)B08的SOD酶活性仍最大，B04次之，B02和B03的SOD酶活性較小，且與其他種質(zhì)差異顯著（P＜0.05）。

隨處理溫度的增加，各種質(zhì)的CAT酶活性和POD酶活性（除B01種質(zhì)外）均呈逐漸升高趨勢。在兩個高溫處理下，種質(zhì)B08的POD酶活性最高，B04和B05的CAT酶活性最高。

2.2 高溫脅迫下百脈根各生理生化指標的相關(guān)性分析 高溫脅迫下，百脈根種質(zhì)各生理生化指標間均存在不同程度的相關(guān)性（表1）。其中相對電導率與MDA含量，CAT活性與Pro含量和POD活性均呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）。Pro含量與相對電導率、MDA含量、POD活性，CAT活性與 MDA含量間均呈顯著相關(guān)（P＜0.05）。

圖1 高溫脅迫對百脈根生理生化指標的影響Fig.1 Effects of high temperature stresses on physiological and biochemical index of Lotus corniculatus

表1 高溫脅迫下百脈根各生理生化指標的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of physiological biochemical indexes of Lotus corniculatus under high temperature stress

2.3 生理生化指標的主成分分析 經(jīng)過主成分分析將6個單項指標轉(zhuǎn)換成6個主成分，其中前兩個主成分的貢獻率分別為57.20%和28.21%，累積貢獻率為85.41%（表2）。按累積貢獻率≥85%確定主成分個數(shù)［11］，選擇前兩個主成分作為評價百脈根耐熱性的綜合指標。表2列出了各主成分的特征向量值，以X（1）和X（2）分別代表第1和第2主成分，X1～X6分別表示6個單項生理指標，以各指標的特征向量為系數(shù)，可得到兩個綜合指標與原6項單項指標的線性組合方程。

主成分特征向量越大，各單項指標對綜合指標的貢獻度越大［10］。百脈根種質(zhì)耐熱性評價第1主成分中CAT活性和MDA含量的特征向量較大，其次是Pro含量和相對電導率；第2主成分中SOD活性的特征向量最大，其次為POD活性。植物受到高溫脅迫時，細胞膜系統(tǒng)受到傷害，膜透性增強，相對電導率增加；細胞膜發(fā)生膜脂過氧化作用，膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量增加。CAT活性和Pro含量的增加均有利于維持細胞膜的穩(wěn)定。因此，第1主成分主要反映高溫脅迫條件下維持生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因子；SOD和POD是細胞內(nèi)重要的保護酶，因此，第2主成分主要反映高溫脅迫條件下生物體內(nèi)保護酶系統(tǒng)。

2.4 耐熱性的綜合評價 根據(jù)主成分表達式及隸屬函數(shù)公式分別求得百脈根種質(zhì)的各綜合指標值X（i）及其隸屬函數(shù)值U（x）和綜合耐熱D值（表3），根據(jù)各綜合指標的貢獻率及累積貢獻率，利用公式（2）可分別求出各綜合指標的權(quán)重。經(jīng)計算，兩個綜合指標的權(quán)重分別為0.669 7和0.330 3。

耐熱性綜合評價值（D）值越大表明耐熱性越強，反之則越弱。綜合3個溫度梯度下8個百脈根種質(zhì)資源的 D值，其大小分別為B01（0.567 6）、B02（0.664 3）、B03（1.129 0）、B04（1.589 1）、B05（1.520 8）、B08（1.757 2）、B12（1.108 8）和 B18（1.416 9）。

3 討論與結(jié)論

高溫脅迫已成為影響植物生長發(fā)育的主要逆境因素［17］。大量研究表明，高溫脅迫下，植物為了抵御高溫，體內(nèi)會發(fā)生一系列的生理生化變化，細胞膜透性、MDA含量、Pro含量、SOD酶活性、POD酶活性和CAT酶活性都會發(fā)生變化。不同種、甚至不同品種間上述指標的變化情況因植物對高溫耐受性的不同而不同，因此，常被用于植物耐熱性評價指標［18－20］。本研究中，各百脈根種質(zhì)隨高溫脅迫強度的增加，相對電導率和MDA含量上升，Pro含量增加，CAT和POD酶活性（除B01種質(zhì)外）均呈升高趨勢，SOD酶活性呈先升高后降低趨勢，表明高溫脅迫下，百脈根細胞膜脂中不飽和脂肪酸發(fā)生氧化，導致生物膜破壞，膜透性增強，細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，相對電導率值增大；MDA是膜脂過氧化最終分解產(chǎn)物，葉片中的MDA含量增加表明細胞膜的脂質(zhì)過氧化程度增強。游離脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在高溫脅迫下，各百脈根種質(zhì)Pro含量增加，起到調(diào)節(jié)細胞質(zhì)滲透壓、降低植物細胞酸度、穩(wěn)定細胞大分子結(jié)構(gòu)的作用。SOD、CAT和POD是植物對膜脂過氧化作用的酶促防御體系中的保護酶。其中SOD是植株內(nèi)活性氧清除的第一道防線，酶系統(tǒng)主要是在SOD酶的作用下將·O2－岐化成H2O2和O2，而CAT和POD酶則進一步將H2O2催化生成H2O，從而減少·O2－和H2O2的積累。

表2 高溫脅迫下百脈根各指標的主成分分析Table 2 Principal component analysis of different indexes of Lotus corniculatus under high temperature stress

表3 高溫脅迫下百脈根的綜合指標值X（i）及其權(quán)重、隸屬函數(shù)值U（x）、綜合評價值D及排序Table 3 The values of comprehensive index X（i）and weight，subordinate function value U（x），comprehensive evaluation value D and prediction value of Lotus corniculatus under high temperature stress

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下百脈根各指標間存在不同程度的相關(guān)性，使各指標所提供的信息發(fā)生了重疊。如果直接利用這些指標評價百脈根種質(zhì)的耐熱性強弱，難以得到準確的結(jié)果，需要應(yīng)用主成分分析與隸屬函數(shù)相結(jié)合，進行各百脈根種質(zhì)的耐熱性綜合評價值，這樣既考慮各單項指標間的相互關(guān)系，又兼顧各指標的重要性，也避免了人為確定權(quán)重的主觀性。采用主成分分析法將原來6個彼此相關(guān)的指標轉(zhuǎn)換成兩個相互獨立的綜合指標，累積貢獻率達85.411%。其中第1主成分特征向量較大的是CAT活性和MDA含量，其次是Pro含量和相對電導率；第2主成分特征向量最大的是SOD活性，其次為POD活性。因此第1主成分主要反映了高溫脅迫條件下維持生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因子，第2主成分主要反映了高溫脅迫條件下生物體保護酶系統(tǒng)。

依據(jù)貢獻率大小和累積貢獻率，確定兩個綜合指標的權(quán)重分別為0.669 7和0.330 3。利用綜合指標的隸屬函數(shù)值和權(quán)重，計算出各百脈根種質(zhì)的耐熱性綜合評價值。綜合推測，各種質(zhì)耐熱性順序為B08＞B04＞B05＞B18＞B03＞B12＞B02＞B01。百脈根種質(zhì)B04、B08、B12和B18為貴州本土種質(zhì)資源，其中B08和B04表現(xiàn)出很強的耐熱性，強于市售的南方型品種B05，說明當?shù)乇就涟倜}根種質(zhì)具有優(yōu)良的耐熱性狀，結(jié)合正確的育種手段，對其加以培育和選擇，有望培育出適應(yīng)性更強、穩(wěn)產(chǎn)性更好的新品種。

［1］ 徐桂芬，崔茂盛，匡崇義，等.云南野生優(yōu)良豆科牧草百脈根的開發(fā)利用［J］.牧草與飼料，2012，6（1）：10－11.

［2］ 丁玉川，俞小秋.百脈根的綜合利用［J］.植物雜志，1998（2）：6－7.

［3］ 程星，包愛科，馮波，等.百脈根基因工程研究進展［J］.生物技術(shù)通報，2009（4）：1－6.

［4］ 崔亞飛.百脈根早熟品系特征特性的研究及再生體系建立［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2009.

［5］ 楊志忠，劉法濤，張清斌，等.百脈根栽培技術(shù)及開發(fā)前景［J］.草食家畜，2000（1）：41－42.

［6］ 王玉佳，畢玉芬，姜華，等.干熱脅迫對紫花苜蓿葉片生理特性的影響［J］.草業(yè)科學，2011，28（6）：1014－1018.

［7］ Wahid A，Gelani S，Ashraf M，etal.Heat tolerance in plants：An overview［J］.Environmental and Experimental Botany，2007，61（3）：199－223.

［8］ Mittler R.Abiotie stress，the field environment and stress combination［J］.Trends in Plant Science，2006，11（1）：15－19.

［9］ 張朝陽，許桂芳.利用隸屬函數(shù)法對4種地被植物的耐熱性綜合評價［J］.草業(yè)科學，2009，26（2）：57－60.

［10］ 王凱紅，劉向平，張樂華，等.5種杜鵑幼苗對高溫脅迫的生理生化響應(yīng)及耐熱性綜合評價［J］.植物資源與環(huán)境學報，2011，20（3）：29－35.

［11］ 王凱紅，凌家慧，張樂華，等.兩種常綠杜鵑亞屬幼苗耐熱性的主成分及隸屬函數(shù)分析［J］.熱帶亞熱帶植物學報，2011，19（5）：412－418.

［12］ 趙海明，孫桂枝，王學敏，等.百脈根種質(zhì)苗期抗旱性鑒定及綜合評價［J］.草原與草 坪，2011，31（6）：18－26.

［13］ 李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］.北京：高等教育出版社，2000.

［14］ 鄒琦.植物生理學實驗指導［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

［15］ 高俊鳳.植物生理學實驗技術(shù)［M］.西安：世界圖書出版公司，2000.

［16］ 白志英，李存東，孫紅春，等.小麥代換系抗旱生理指標的主成分分析及綜合評價［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2008，41（12）：4264－4272.

［17］ 林曉紅，施木田，林小蘋，等.3個紅掌盆栽品種的抗熱性比較研究［J］.熱帶作物學報，2012，33（10）：1835－1840.

［18］ 周中亮，包滿珠，王文恩.高溫脅迫對6個高羊茅株系生理指標的影響［J］.草業(yè)科學，2011，28（7）：1284－1290.

［19］ Liu X Z，Huang B R.Heat stress injury in relation to membrane lipid peroxidation in creeping bentgrass［J］.Crop Science，2000，40（2）：503－510.

［20］ 陳志剛，謝宗強，鄭海水.不同地理種源西南樺苗木的耐熱性研究［J］.生態(tài)學報，2003，26（11）：2327－2332.