百脈根分子生物學(xué)主要領(lǐng)域研究進(jìn)展

李宗英，王 丹，邊佳輝，孫占敏，傅 華，呂嘉衛(wèi)，吳燕民

（1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；3. 上海金柯勞沃生物科技有限公司，上海 200000）

百脈根(Lotus corniculatus)，多年生叢生草本植物，隸屬于豆科(Leguminosae)百脈根屬，別名五葉草、牛角花、都草、鳥距草[1-4]。我國百脈根屬共有9種(包括1個變種)，主要產(chǎn)自于西北地區(qū)，分別為翅莢百脈根、蘭嶼百脈根、百脈根、高原百脈根、新疆百脈根、細(xì)葉百脈根、尖齒百脈根、短果百脈根，變種為光葉百脈根。

百脈根多呈匍匐或半匍匐型生長，分枝眾多；葉片為掌狀三出葉，小葉卵圓形或倒卵形[5]；花為傘狀花序，花期長，花量大[6]。百脈根對土壤環(huán)境要求較低，能在高緯度及寒冷干旱地區(qū)生長且適應(yīng)性良好，在裸露坡地種植進(jìn)行邊坡防護(hù)時具有良好的水土保持性能[7-8]；百脈根種植簡便，種子可落地自生，自行繁衍能力強，是建立栽培草地以及改良放牧草地的優(yōu)良種質(zhì)資源[9]。百脈根枝葉柔嫩，營養(yǎng)豐富，干物質(zhì)消化率高，適口性好，各類家畜均喜食，且百脈根莖葉富含縮合單寧，能夠有效降低反芻動物發(fā)生臌脹病的幾率，是極好的牧草和飼料[10]。由于百脈根種子細(xì)小、出苗能力弱、幼苗喜潮濕、與雜草競爭力差等，導(dǎo)致實際生產(chǎn)尚未得以大面積推廣應(yīng)用；但近年來隨著分子生物學(xué)應(yīng)用于多個領(lǐng)域，利用生物技術(shù)方法改良百脈根種質(zhì)資源，揭示百脈根根瘤固氮機理，不僅能夠加快其應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)業(yè)的進(jìn)度，對草原生態(tài)環(huán)境的改良也有深遠(yuǎn)的影響。因此，對百脈根的主要研究方向包括遺傳多樣性與系統(tǒng)進(jìn)化分析、抗逆境脅迫、抗除草劑、根瘤固氮、縮合單寧、作為生物反應(yīng)器以及藥理學(xué)應(yīng)用共7個方面進(jìn)行綜述，對研究過程中存在的不足之處進(jìn)行探討，并對其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望，以期加強百脈根在草業(yè)生產(chǎn)實踐中的資源配置。

1 百脈根遺傳多樣性與系統(tǒng)進(jìn)化分析

百脈根原產(chǎn)于地中海盆地、歐洲和中非部分地區(qū)，生態(tài)范圍廣泛，與物種的多態(tài)性特征遙遙呼應(yīng)；現(xiàn)于世界各地包括歐洲、溫帶地區(qū)的小亞細(xì)亞、北非、美國及我國均有分布[11]。百脈根對不同生境條件的適應(yīng)性導(dǎo)致其形態(tài)、生物學(xué)特性和農(nóng)藝性狀發(fā)生了變異，形成了眾多的生態(tài)類型。研究發(fā)現(xiàn)：高海拔地區(qū)大多數(shù)百脈根種群趨于產(chǎn)生開花晚的半匍匐型植物，而隨著海拔的降低，百脈根莖數(shù)、節(jié)間數(shù)和莖長逐漸增加[12-13]。為提高百脈根利用效率，Kramina等[14]對百脈根的種質(zhì)育種方面展開了分析，通過比較兩個百脈根種群經(jīng)自交和多向雜交后代的存活率與種子產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，多向雜交后代的存活率高于自交后代，并且多向雜交產(chǎn)生的豆莢大小以及豆莢內(nèi)種子數(shù)均優(yōu)于自交后的豆莢大小及豆莢內(nèi)種子數(shù)；而使用基因型不同的2個品種與27個異源百脈根品系進(jìn)行雜交并對F1代的活力、花粉萌發(fā)、豆莢長度及每個豆莢產(chǎn)生種子數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：基因型的雜交能力與采集地點的生態(tài)地理特征有關(guān)，但與形態(tài)特征無關(guān)。

小學(xué)階段的學(xué)生對新事物充滿好奇，對生活的一切都有著較大的探索興致。因此，教師在開展思想品德教育時，要為學(xué)生創(chuàng)造既豐富又熟悉的教學(xué)情境，將課堂教學(xué)內(nèi)容和學(xué)生的衣食住行聯(lián)系起來，真正引導(dǎo)其意識到思想品德課程的重要性。例如，教師在講解《互幫互助一家親》的章節(jié)內(nèi)容時，可以先請學(xué)生回憶自己和家人一起合作完成的某件事，然后再將學(xué)生分成若干人一組，通過游戲比賽的形式讓學(xué)生體會團(tuán)結(jié)協(xié)作的重要性，在促進(jìn)學(xué)生與學(xué)生之間感情的同時提升教學(xué)效率和質(zhì)量。

好啦孫滑頭，現(xiàn)在的關(guān)鍵是你馬上去牛皮糖那里，想辦法請他出院，不管用什么辦法，總之今天就讓他出來。否則我扣你的工資。

②建設(shè)農(nóng)田過濾帶。選擇設(shè)施農(nóng)業(yè)大棚區(qū)北側(cè)的1號渠，沿渠道北側(cè)布置600 m的農(nóng)田過濾帶，采用截流溝、植被過濾帶等6種不同的配置模式（見表1），降低農(nóng)田徑流污染物濃度，減少入河污染物。

百脈根作為醫(yī)學(xué)上重要的植物，亦可用于草藥制劑。百脈根的花可用作抗痙攣與鎮(zhèn)靜劑，根可用作驅(qū)風(fēng)劑以及退熱藥[46]。Salman對收集的百脈植物營養(yǎng)元素進(jìn)行定性和定量測定，發(fā)現(xiàn)根系含有多種植物化學(xué)物質(zhì)，包括生物堿、類固醇、皂苷、鞣酸、還原糖、蒽醌、蒽醌苷、碳水化合物和蛋白質(zhì)等；莖存在生物堿、單寧、皂苷、類黃酮、類固醇、還原糖、蒽醌和萜類化合物；葉片含有生物堿、單寧、皂苷、類固醇和還原糖；說明百脈根植物化學(xué)成分較為豐富，其中葉莖中重要的植物化學(xué)成分較多。進(jìn)一步研究百脈根提取物對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒沙門氏菌和肺炎球菌的活性均受到抑制(大腸桿菌、傷寒沙門氏菌和肺炎球菌是引起胃病，腸道和肺部炎癥的主要原因)，而銅綠假單胞菌則不受影響[47-48]。從百脈根種子分離的凝集素對人體白血病細(xì)胞系(THP-1)和肺癌細(xì)胞系(HOP62)和結(jié)腸癌細(xì)胞系(HCT116)的增殖有相當(dāng)大的抑制作用，對THP-1細(xì)胞進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，隨著凝集素濃度的增加，THP-1細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生顯著改變，表明LCL誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡，通過形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，百脈根凝集素處理的THP-1細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞凋亡特征，如核碎裂，染色質(zhì)濃縮和線粒體膜電位的喪失等[49]。百脈根還可以通過抑制白細(xì)胞流入和滲出物濃度而呈現(xiàn)出極為重要的抗炎作用[50]以及抗胃腸線蟲的保健食品的作用[40]。

必修3統(tǒng)計章節(jié)包含抽樣方法（簡單隨機抽樣、系統(tǒng)抽樣、分層抽樣）、總體分布的估計（頻率分布表、頻率分布直方圖與折線圖、莖葉圖）、總體特征數(shù)的估計（平均數(shù)及其估計、方差與標(biāo)準(zhǔn)差）、線性回歸方程．選修2-3章節(jié)包含獨立性檢驗（統(tǒng)計量）、回歸分析（隨機誤差、線性回歸模型、相關(guān)系數(shù)）．

對百脈根的資源評價應(yīng)用方面也有相應(yīng)研究。如，對里奧、邁瑞伯以及早熟品系的農(nóng)藝性狀、越冬率及生長速率等指標(biāo)進(jìn)行評價發(fā)現(xiàn)，早熟品系的生長速率、產(chǎn)草量皆顯著高于其他兩個品系[20]；通過對21份百脈根種質(zhì)材料的抗旱性進(jìn)行綜合評定，發(fā)現(xiàn)干旱條件對百脈根種子萌發(fā)具有顯著的抑制作用[21]，并從當(dāng)中篩選出7份抗旱性較強的百脈根材料[22]；陳超等[23]對8份百脈根材料的生理生態(tài)指標(biāo)進(jìn)行分析，為百脈根材料的篩選提供了理論依據(jù)；張本瑜和師尚禮[24]以3份中國百脈根材料作為對照，研究了73份俄羅斯百脈根的營養(yǎng)指標(biāo)和飼喂價值，篩選出13份價值較高的百脈根材料，為百脈根遺傳育種與推廣種植提供了依據(jù)；Hunt等[25]對美國愛達(dá)荷州南部和猶他州北部的5個商業(yè)有機奶牛場建立的百脈根牧場進(jìn)行評估，證明了利用百脈根構(gòu)建人工牧場的可實行性。

建筑工程設(shè)計工作是影響工程造價的主要因素，體現(xiàn)在設(shè)計人員與圖紙方面。對于設(shè)計人員，如果專業(yè)素質(zhì)不能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，沒有掌握先進(jìn)技能與專業(yè)基礎(chǔ)，在設(shè)計期間很容易影響工程造價，無法將工程造價控制與施工設(shè)計聯(lián)系在一起。施工設(shè)計圖會直接影響工程成本，如果不能在施工前期進(jìn)行設(shè)計圖紙的審核與完善，在施工中很容易出現(xiàn)變更現(xiàn)象，不利于進(jìn)行造價的管理與控制，難以形成良好的發(fā)展體系。

2 百脈根的生物學(xué)特性研究

2.1 共生固氮

豆科植物能夠分泌一種類黃酮化合物或相關(guān)化合物，此類化合物通過誘導(dǎo)結(jié)瘤基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生能夠分泌根瘤菌的信號分子-結(jié)瘤因子。同時，結(jié)瘤因子會反作用于豆科植物刺激根瘤發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，直至成功的在寄主植物根部形成根瘤。

從百脈根中相繼克隆得到NIN[26]、SymPK[27]、NFR1和NFR5[28]、NUP133[29]和NUP85[30]以及CCa-MK[31]等基因。其中，結(jié)瘤起始基因NIN的主要功能是調(diào)控根瘤發(fā)育中下游基因的表達(dá)；激酶受體基因SymPK是感知微生物信號分子到快速啟動共生關(guān)聯(lián)基因的共生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑所必需的；NFR1和NFR5是一種含有LysM結(jié)構(gòu)域結(jié)瘤因子受體蛋白激酶，它們主要參與并傳遞結(jié)瘤因子信號；NUP133和NUP85基因在百脈根中的核質(zhì)信息交流過程中起作用；CCaMK作為鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶，當(dāng)鈣調(diào)素結(jié)合位點缺失或自磷酸化位點突變，會導(dǎo)致百脈根在無根瘤菌條件下，形成自發(fā)根瘤或者與結(jié)瘤相關(guān)基因的表達(dá)。此外還有許多基因(表1)同樣參與百脈根結(jié)瘤因子感知和隨后的共生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、根瘤侵入線的形成以及結(jié)節(jié)器官發(fā)生等過程。

激素在百脈根結(jié)瘤中起到了重要的調(diào)控作用。其中生長素(IAA)、細(xì)胞分裂素(CTK)、赤霉素(GA)作為正調(diào)節(jié)因子在百脈根根瘤形成過程中發(fā)揮功能，而茉莉酸(JA)、水楊酸、脫落酸(ABA)和乙烯作為負(fù)調(diào)節(jié)因子抑制百脈根的結(jié)瘤。百脈根還存在結(jié)瘤自主調(diào)節(jié)機制(AON)，通過根-莖之間的長距離信號來控制結(jié)瘤數(shù)目。百脈根AON的缺陷突變體Har1可以在除莖頂端外的多種器官內(nèi)廣泛表達(dá)，主要接受來自于根部的信號繼而在莖中產(chǎn)生結(jié)瘤抑制因子來抑制結(jié)瘤。此外KLA(KLAVIER)也是百脈根AON中不可缺少的一環(huán)，和Har1在遺傳途徑中行使相同的功能。除了AON表現(xiàn)出的內(nèi)部信號，外界環(huán)境刺激也能夠影響百脈根的結(jié)瘤：對百脈根根部進(jìn)行強烈的光照能夠有效抑制結(jié)瘤，但將百脈根突變體astray置于強光的照射下，結(jié)瘤正常發(fā)生[32]。研究有機肥和無機肥對百脈根結(jié)瘤活性的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)施用有機肥料時百脈根的根系數(shù)目會顯著增加，但會抑制百脈根結(jié)瘤，而施用硝酸鉀、復(fù)合肥料或過磷酸鹽處理百脈根時，其根部的結(jié)瘤數(shù)增加了兩倍[33-34]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物的傷口部位，體外生根培養(yǎng)后接種根瘤菌，在轉(zhuǎn)化植株上形成的根瘤具較高的固氮酶活性[35]。使用發(fā)根農(nóng)桿菌將完整的大豆血紅蛋白Lbc3基因轉(zhuǎn)移到豆科植物百脈根中，根瘤菌感染后，在再生的轉(zhuǎn)基因百脈根上形成的根瘤中觀察到Lbc3基因的特異性表達(dá)[36]。

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 縮合單寧

2.2.3 縮合單寧對動物生產(chǎn)的影響

遺傳和環(huán)境變量是影響百脈根中縮合單寧含量的主要因素。一般來說，在不同生長階段以及不同器官內(nèi)縮合單寧含量有所差異，其濃度會隨著百脈根的成熟度增加而增加，并且與組織中木質(zhì)素的含量正相關(guān)[37-38]。縮合單寧含量與土壤中的營養(yǎng)成分息息相關(guān)，濕地百脈根(L. uliginosus)中縮合單寧(CT)含量會隨著有效磷和有效硫含量的增加而增加，但是在百脈根中卻無顯著的變化[39]。溫度和水分脅迫也會共同作用影響縮合單寧的含量，如：濕地百脈根中縮合單寧含量在夏季和秋季升高，可能是因為溫度升高以及水分脅迫造成植物生長速率下降，造成CT濃度大幅度上升，但是百脈根卻沒有受到太大的影響[40]。品種選育和刈割管理也可調(diào)節(jié)百脈根品種的CT水平。此外，通過分子技術(shù)將丹寧合成的關(guān)鍵酶基因DFR(dihydroflavone reductase)轉(zhuǎn)入百脈根中，發(fā)現(xiàn)單寧的含量顯著增加，而將反義雙氫黃酮醇還原酶引入百脈根中，反而導(dǎo)致根、莖、葉中CT含量降低，但對生物量完全沒有影響[41]。

2.2.1 縮合單寧對動物疾病的影響

反芻動物容易受到由內(nèi)寄生蟲感染所引起的一些疾病的影響。近年來，寄生蟲驅(qū)蟲抗性的增加表明，有必要找到其他替代方法來控制寄生蟲的生長。試驗證明，含有CT的植物對反芻動物具有良好的驅(qū)蟲效果：對羔羊放牧百脈根后，發(fā)現(xiàn)從皺胃到大腸的胃腸線蟲逐漸減少，并且從百脈根中提取的縮合單寧對胃腸幼蟲和鹿肺蟲有抑制作用[42-43]。目前已經(jīng)研究了大量涉及含有CT的百脈根對于殺蟲活性的研究，但其潛在的機制仍然知之甚少，需要進(jìn)一步深入研究。

表 1 百脈根中控制結(jié)瘤的主要基因Table 1 The main genes controlling nodule formation in L. corniculatus

1)轉(zhuǎn)化效率低下。百脈根主要是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，外源基因整合到百脈根基因組上的成功率較低。針對不同的百脈根品種，遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立仍然不夠成熟，嚴(yán)重影響分子育種進(jìn)程。

蛋白質(zhì)是決定飼草價值的關(guān)鍵成分。當(dāng)飼料進(jìn)入動物的瘤胃時，蛋白質(zhì)將被瘤胃中的微生物分解，導(dǎo)致飼料的營養(yǎng)價值降低。因此，植物蛋白必須在瘤胃中結(jié)合，以防止瘤胃微生物的降解并保證在皺胃中釋放，以促進(jìn)小腸中氨基酸的水解和吸收。CT是一種天然的黃酮類化合物，可以通過與蛋白質(zhì)的氫鍵反應(yīng)而形成穩(wěn)定的復(fù)合物，稱為CT-蛋白質(zhì)復(fù)合物。當(dāng)pH在3.5～7.0時，微生物酶活性將會降低從而影響蛋白水解細(xì)菌的生長速率；然而當(dāng)pH ＜ 3.5時，CT-蛋白質(zhì)復(fù)合物將解離并釋放蛋白質(zhì)[44]。在百脈根中添加PEG作為對照組(PEG的功能是結(jié)合和滅活縮合單寧)，將含有21.7 g·kg-1干物質(zhì)(DM)縮合單寧的百脈根作為實驗組分別飼養(yǎng)動物，發(fā)現(xiàn)實驗組體內(nèi)尿素濃度顯著降低，大部分氨基酸濃度升高[45]，表明含有縮合單寧的百脈根能夠有效促進(jìn)動物對牧草所含蛋白質(zhì)的利用，而不會影響動物的自由采食量。

縮合單寧廣泛存在于雙子葉植物當(dāng)中，但卻很少在禾本科植物當(dāng)中發(fā)現(xiàn)。不同的雙子葉植物中，縮合單寧的組織特異性定位有所不同。例如，在紫花苜蓿(Medicago sativa)中縮合單寧僅限存在于種皮中，而在白三葉(Trifolium repens)和紅三葉(T. pratense)中縮合單寧僅存在于花中。

從產(chǎn)業(yè)學(xué)院創(chuàng)建目標(biāo)上看，產(chǎn)業(yè)學(xué)院不是以盈利為目標(biāo)，而是在培養(yǎng)行業(yè)需要的實踐人才基礎(chǔ)上充分協(xié)調(diào)校企雙方訴求，達(dá)到互助互利，全面協(xié)調(diào)可持續(xù)發(fā)展。由此出發(fā)，浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院與泰格醫(yī)藥共建產(chǎn)業(yè)學(xué)院職能定位為：集人才培養(yǎng)、技術(shù)服務(wù)及培訓(xùn)等功能為一體。一方面成為學(xué)校的產(chǎn)學(xué)研基地、“雙師型”教師企業(yè)培訓(xùn)崗位、創(chuàng)新班畢業(yè)生實訓(xùn)基地，另一方面成立合作企業(yè)的人才培養(yǎng)中心，共建產(chǎn)業(yè)學(xué)院品牌及形象。[5]

百脈根中的CT含量對反芻動物的生產(chǎn)尤其是羊毛生長、產(chǎn)奶量、排卵率和產(chǎn)羔率等方面具有顯著的影響。研究發(fā)現(xiàn)，中濃度的縮合單寧(20～45 g·kg-1)可以減少植物蛋白的瘤胃降解，增加粗蛋白質(zhì)流向腸道，從而提高綿羊從飼料中獲取養(yǎng)分的能力。然而，高濃度的CT (50 g·kg-1)會降低反芻動物的自由采食量和消化率，從而降低反芻動物體和羊毛生長的速度。對羔羊飼喂百脈根時，CT的主要作用是增加羊毛的生長速率，提高羊毛的生產(chǎn)率，并且發(fā)現(xiàn)，飼喂百脈根的羔羊胴體增重高于飼喂苜蓿的；對交配期的綿羊飼喂百脈根，CT則通過增加繁殖力和減少胚胎損失來提高綿羊的繁殖率；在母羊飼養(yǎng)羊羔的條件下飼喂百脈根，CT則會增加母羊的產(chǎn)奶量[40]。

2.3 藥用特性

在百脈根的遺傳變異方面也有大量研究。如：利用源于俄羅斯的15份百脈根材料，對Intersimple Sequence Repeat (ISSR)反應(yīng)的5個因素進(jìn)行優(yōu)化并探索出適宜百脈根的ISSR反應(yīng)體系[15]；利用Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)和Simple Sequence Repeats (SSR)方法分析11份意大利的百脈根的遺傳變異發(fā)現(xiàn)，種群內(nèi)變異數(shù)較高，但相比而言種群間變異數(shù)更大[16]；Abraham等[17]研究了百脈根遺傳變異性與地方生境類型和物種多樣性的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)百脈根遺傳多樣性與種群內(nèi)或種群間的物種多樣性并不相關(guān)，而與百脈根豐富度負(fù)相關(guān)，在其他學(xué)者的研究中也報道了類似的結(jié)果[18]；Santosr等[19]探索了美國農(nóng)業(yè)部國家植物種質(zhì)資源庫中28份百脈根材料的遺傳、形態(tài)、生態(tài)和地理距離相互之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)基因型的形態(tài)學(xué)相似性與采集點距離和采集點生態(tài)相似性有關(guān)，其特定的形態(tài)特征與不同的生態(tài)地理特征有關(guān)；遺傳和生態(tài)之間的相似性表明具有相似生境的基因型，即使在地理上相距遙遠(yuǎn)，也能獲得相似的表型。

3 百脈根的遺傳改良

3.1 遺傳轉(zhuǎn)化體系

目前，百脈根的遺傳轉(zhuǎn)化體系主要通過發(fā)根農(nóng)桿菌、根癌農(nóng)桿菌和激光介導(dǎo)，而根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是研究機理最清楚、技術(shù)方法最成熟、應(yīng)用最普遍的遺傳轉(zhuǎn)化途徑[51]，但是該方法轉(zhuǎn)化效率最高僅為30%，因此對影響遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素進(jìn)行深入研究，有利于提高百脈根的遺傳轉(zhuǎn)化效率。

3.1.1 外植體

百脈根遺傳轉(zhuǎn)化過程中常用的外植體材料主要有子葉、真葉、莖段和下胚軸等。由于子葉和下胚軸不定芽分化頻率高、再生苗生長狀況良好，而真葉和莖段轉(zhuǎn)化時存在再生速率低，玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重的缺點，因而子葉和下胚軸是目前常用的外植體材料。但實際操作過程中下胚軸容易損傷，而子葉無需通過愈傷組織形成階段或僅有少量愈傷組織形成，降低了遺傳轉(zhuǎn)化過程中突變的發(fā)生幾率并縮短了子葉到再生芽的發(fā)育時間，顯著提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率，因而子葉被認(rèn)為是百脈根轉(zhuǎn)化的最佳外植體材料[52]。張依然[53]的研究也報道了類似的結(jié)果，并認(rèn)為帶柄子葉具有相較于不帶柄子葉再生率更高。

廣巧將抗禽傳染性法式囊病毒活性的雞α干擾素ChIFN-α基因轉(zhuǎn)入百脈根中并使得外源基因在百脈根中正確翻譯和轉(zhuǎn)錄表達(dá)，對轉(zhuǎn)基因百脈根進(jìn)行生理生化研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因百脈根根系發(fā)達(dá)，生長加快、始花期提前，盛花期延長，并顯著地提高了百脈根的低溫耐受性[87]。王煒等[88]通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)基因vp1[89]和P12A-3C 分別轉(zhuǎn)入百脈根并進(jìn)行篩選，檢測結(jié)果表明，目的基因已經(jīng)成功的整合到百脈根基因組中，具有轉(zhuǎn)錄活性，且目的蛋白表達(dá)正確，并對陽性植株進(jìn)行擴繁，這說明利用百脈根作為生物反應(yīng)器表達(dá)FMDW抗原蛋白的方法是完全可行的。郭倩倩等[78]首次使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法使編碼H5N1亞型禽流感病毒血凝素(AIVHA)基因轉(zhuǎn)入百脈根品種“里奧”中成功的表達(dá)。唐廣立等[90]將兔出血癥病毒(RHDV)衣殼蛋白VP60基因轉(zhuǎn)入到百脈根并進(jìn)行成功表達(dá)；賀紅霞等[91]將乙肝表面抗HBsAg基因轉(zhuǎn)入百脈根基因組并表達(dá)；楊宗岐等[92]構(gòu)建出豬瘟病毒主要抗原E2基因，然后在百脈根葉綠體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)動物疫苗的可食用性攝入。

農(nóng)桿菌濃度和侵染時間的選擇對轉(zhuǎn)化效率也有影響。較高的農(nóng)桿菌濃度(OD600nm＞ 0.8)或侵染時間將會導(dǎo)致附著在外植體表面或進(jìn)入外植體組織中的工程菌數(shù)量增多，造成農(nóng)桿菌大量擴繁，抑制外植體細(xì)胞的分裂；較低的農(nóng)桿菌濃度(OD600 nm＜0.3)或侵染時間導(dǎo)致僅有少量的工程菌進(jìn)入外植體組織中，降低了外植體獲得外源基因的幾率。研究發(fā)現(xiàn)，工程菌液(LB4404)OD600nm= 0.5時，對外植體子葉節(jié)侵染30 min左右時能獲得最高的外植體誘導(dǎo)率[61]。賈永紅等[52]使用農(nóng)桿菌(EHA105)侵染子葉發(fā)現(xiàn)工程菌液OD600nm為0.5 ± 0.05，侵染30 min轉(zhuǎn)化效果最顯著。因而針對不同的農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)化所需要的農(nóng)桿菌濃度及侵染時間還需要進(jìn)一步明確。

3.1.2 農(nóng)桿菌

植物對不同農(nóng)桿菌侵染的敏感性不同，造成了轉(zhuǎn)化效率之間的差異。百脈根遺傳轉(zhuǎn)化過程所使用的根癌農(nóng)桿菌主要包括AGLO、LBA4404[55]、AGL1[56]、EHA101[57]、EHA105和GV3101[58]等。將EHA105菌株作為宿主菌轉(zhuǎn)化百脈根時，具有比LBA4404和GV3101菌株更高的再生芽分化率和成苗后轉(zhuǎn)化率；將根癌農(nóng)桿菌AGL1、EHA105和LBA4404分別轉(zhuǎn)化到百脈根發(fā)現(xiàn)，相較于EHA105和LBA4404菌株，AGL1菌株對百脈根再生芽的分化率為20%，是LBA4404和EHA105菌株的1.71和2.40倍，表明AGL1菌株更適宜于轉(zhuǎn)化百脈根[59-60]。

不同生長時期的外植體對百脈根遺傳轉(zhuǎn)化也有很大影響。由于5 d之前大部分無菌苗種皮尚未脫落，子葉較小尚未完全展開，實驗操作不易；而5 d之后子葉的轉(zhuǎn)化率反而隨著苗齡的增長而降低，苗齡達(dá)到8 d時已經(jīng)無法獲得轉(zhuǎn)化植株[54]，因此，以5 d苗齡的子葉為佳。

3.1.3 預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)

對外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)將有益于百脈根轉(zhuǎn)化效率的提高。預(yù)培養(yǎng)時間過短達(dá)不到預(yù)期效果，時間過長則不利于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，甚至?xí)斐赏庵搀w死亡。針對不同外植體，探索最佳預(yù)培養(yǎng)時間是百脈根遺傳轉(zhuǎn)化所必需的。賈永紅等[52]對外植體預(yù)培養(yǎng)3～4 d后，子葉增大變厚，下胚軸長大增粗，轉(zhuǎn)化效率得以顯著提高。張怡然[53]發(fā)現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)2 d對外植體子葉節(jié)的誘導(dǎo)率最高。Lombari等[62]將根作為外植體轉(zhuǎn)化時，經(jīng)過5 d的預(yù)培養(yǎng)期觀察到根部厚度得以顯著增加。

在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中，共培養(yǎng)階段是外植體與農(nóng)桿菌直接接觸的時期，在此階段使用適宜的方法可以提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。Handberg[63]發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上平鋪一層無菌濾紙并培養(yǎng)7 d能夠顯著提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率。劉建利[51]和張振霞[64]均認(rèn)為對外植體共培養(yǎng)3 d，有益于不定芽的分化。

3.1.4 乙酰丁香酮

2.1.2 數(shù)據(jù)需求分析。以內(nèi)蒙古范圍內(nèi)的基礎(chǔ)地理信息底圖數(shù)據(jù)和社會人口經(jīng)濟需從各年度進(jìn)行統(tǒng)計，將統(tǒng)計結(jié)果抽取匯總到Excel表格中，并實現(xiàn)通過系統(tǒng)功能導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫。

植物細(xì)胞在受傷情況下自身會分泌酚類物質(zhì)，該類物質(zhì)能夠誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因活化，吸引農(nóng)桿菌向受傷的植物組織遷移[65]。因而在遺傳轉(zhuǎn)化過程中添加此類物質(zhì)能夠顯著提高轉(zhuǎn)化率。乙酰丁香酮(AS)是誘導(dǎo)效果最顯著的酚類化合物[66]。孫艷香等探討了AS對百脈根轉(zhuǎn)化率的影響，發(fā)現(xiàn)在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入20 mg·L-1的AS效果最佳；當(dāng)AS濃度超過40 mg·L-1時，轉(zhuǎn)化效率逐漸降低，外植體有褐化趨勢；當(dāng)濃度達(dá)到100 mg·L-1時，外植體全部死亡?？赡苁怯捎诙喾友趸复呋疉S形成褐色的醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)在酪氨酸酶等作用下，與外植體組織中的蛋白質(zhì)聚合，引起其他酶系統(tǒng)失活，導(dǎo)致組織代謝活動紊亂，生長停滯，最終衰老死亡[54]。

3.1.5 負(fù)壓處理

在農(nóng)桿菌侵染外植體過程中進(jìn)行負(fù)壓處理也會提高轉(zhuǎn)化效率，主要是由于負(fù)壓處理致使外植體表面形成眾多細(xì)小的傷口，導(dǎo)致傷口處酚類物質(zhì)的產(chǎn)生，吸引農(nóng)桿菌向受傷的植物組織遷移，從而提高了轉(zhuǎn)化的可能性。然而過高的負(fù)壓會對外植體和農(nóng)桿菌細(xì)胞造成較大的傷害，不利于芽的再生[67-68]。因而針對不同的植物材料，選用不同程度的負(fù)壓進(jìn)行處理。孫艷香等[54]將5 d苗齡的百脈根子葉置于-0.05 MPa壓力下進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)無任何處理下的轉(zhuǎn)化率為13.8%；而在5 min負(fù)壓處理下百脈根的轉(zhuǎn)化率可達(dá)19.0%，說明0.05 MPa負(fù)壓處理5 min能夠顯著提高EHA105介導(dǎo)的百脈根遺傳轉(zhuǎn)化率。此外，基本培養(yǎng)基的選擇以及激素類型等因素對百脈根的遺傳轉(zhuǎn)化效率也有影響，且在程星等[69]的文章中描述較多，因此本文不作探討。

3.2 抗逆性的遺傳改良

對抗逆性的研究已經(jīng)成為現(xiàn)今生物技術(shù)研究的熱門領(lǐng)域之一，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以將外源抗逆基因?qū)胫参镏校岣咧参锏目鼓嫘阅?。陳燕等[59]利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法首次將mtlD基因(1-磷酸甘露醇脫氫酶)轉(zhuǎn)入百脈根中，并使其成功表達(dá)；侯敬堯[70]成功地構(gòu)建了含有目的基因TPS1(海藻糖-6-磷酸合成酶基因)的可剔除選擇性篩選標(biāo)記的載體，并將其轉(zhuǎn)入百脈根中使其成功表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)TPS1基因百脈根的抗旱能力得到了顯著的提高。擬南芥液泡膜H+-焦鹽酸酶編碼基因AVP1在百脈根中超表達(dá)，增強了轉(zhuǎn)基因百脈根植株的耐鹽性和抗旱性[69,71]。大豆液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因GmNHX1在百脈根當(dāng)中過表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因百脈根的耐鹽性[72]。AP2 / ERF家族在多重脅迫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，百脈根中AP2 / ERF家族基因的全基因組進(jìn)行分析顯示LcAP2 / ERF107、ERF054和ERF080均可提高百脈根的耐鹽性[73-74]。轉(zhuǎn)錄因子PeDREB2a和KcERF的共表達(dá)改善了轉(zhuǎn)基因百脈根的耐旱性和耐鹽性[75]。此外，筆者還整理了已經(jīng)在百脈根中成功表達(dá)的外源基因(表2)。

鋁(Al)毒性已被認(rèn)為是酸性土壤植物生產(chǎn)力的一個重要限制因素，大部分Al都是無害的氧化物或硅鋁酸鹽，當(dāng)自然過程或人類活動致使土壤變?yōu)樗嵝酝寥罆r，Al會轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸镜娜齼r陽離子Al3+[82]。Navascués等利用水培法使用不同的Al濃度處理百脈根發(fā)現(xiàn)，10 μmol·L-1鋁濃度足以抑制百脈根根和芽的生長，并影響根細(xì)胞某些代謝物產(chǎn)生和蛋白質(zhì)的含量，但不會造成活性氧的積累或氧化應(yīng)激反應(yīng)；增加鋁濃度至20 μmol·L-1會引起活性氧積累和氧化應(yīng)激反應(yīng)，并且能夠加強有機酸和碳水化合物代謝作用以及氧化還原調(diào)節(jié)作用[76]。

百脈根是全球范圍內(nèi)比較受歡迎的商業(yè)型牧草之一，但由于百脈根大田種植過程中出現(xiàn)大量的雜草嚴(yán)重影響了商業(yè)化種子的生產(chǎn)，因此限制與幼苗競爭水分、養(yǎng)分和光照的雜草對于迅速建立和保持高質(zhì)量的百脈根來說顯得尤為重要，而對抗除草劑百脈根的開發(fā)可能有利于解決雜草管理問題[77]。草胺膦除草劑(PPT)對環(huán)境施用安全，易被土壤微生物代謝成天然成分并且不會引起土壤污染和植物體內(nèi)毒素積累而被廣泛使用。PPT通過對谷氨酰胺合成酶GS的抑制而引起氨迅速積累到植物毒性水平，植物光合作用受損，隨后導(dǎo)致植物細(xì)胞和組織死亡[80]?？筆PT的基因是從吸水鏈霉菌的雙丙氨膦生物合成基因簇中分離的能夠編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)的雙丙氨膦抗性基因(Bar)，它能夠通過乙?；瘜PT解毒從而防止PPT毒性的產(chǎn)生[81]。劉艷芝等[85]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將Bar基因引入百脈根，使得轉(zhuǎn)基因百脈根對草胺膦除草劑擁有良好的抗性并且Bar基因能夠在子代中穩(wěn)定表達(dá)?；酋ｋ孱惓輨┚哂惺┯寐实汀⑼寥腊胨テ诙毯偷投镜膬?yōu)點，因此使用較為廣泛，而其中最著名的便是氯磺隆(CS)，它通過與乙酰乳酸合成酶(ALS)結(jié)合并使其失活，抑制必需支鏈氨基酸的生物合成而發(fā)揮作用。Pofelis等[86]在愈傷組織、芽和全植物水平上相繼使用磺酰脲類除草劑進(jìn)行篩選，最終分離出了具有抗磺酰脲類除草劑能力的百脈根。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)除草劑抗性性狀是可遺傳的，但是抗性基因型種子萌發(fā)率遠(yuǎn)低于野生型種子，造成這種現(xiàn)象的原因目前仍待研究。

面對國家節(jié)約減排的號召以及資源形勢嚴(yán)峻的現(xiàn)實，控制系統(tǒng)也逐年呈現(xiàn)出自動化的過程。目前主要我國電氣工程主要應(yīng)用DCS控制系統(tǒng)并采取集中控制手段，是控制系統(tǒng)自動化的典型代表。DCS系統(tǒng)意為分布式控制系統(tǒng)，它以微處理器作為基本元件以控制功能分散、顯示操作集中、兼顧分而治之和綜合協(xié)調(diào)為設(shè)計原則，具有數(shù)據(jù)獲取直接數(shù)字控制、人機交互以及監(jiān)控和管理等功能。與以前的傳統(tǒng)式控制系統(tǒng)相比，它是一種更加高級的、完善的控制與管理系統(tǒng)。集中控制系統(tǒng)是將各種信息統(tǒng)一放入一個處理器的綜合運用的技術(shù)手段。這種處理目前還存在著一些缺陷，需要繼續(xù)完善和提升。

3.3 作為生物反應(yīng)器

生物反應(yīng)器技術(shù)以其成本低、產(chǎn)量大、安全性好等優(yōu)點得到了廣泛的應(yīng)用。豆科牧草因較高的蛋白質(zhì)含量而廣泛應(yīng)用于植物生物反應(yīng)器表達(dá)系統(tǒng)，通過將抗原蛋白基因轉(zhuǎn)入植物基因組中進(jìn)行表達(dá)來生產(chǎn)動物口服型疫苗。而百脈根正是用于探索作為生物反應(yīng)器的優(yōu)良受體，在口蹄疫病毒、禽流感病毒、兔出血癥病毒、乙肝表面抗原以及豬瘟病毒等方面進(jìn)行廣泛的研究。

在整地之前施用含枯草芽孢桿菌、膠凍樣類芽孢桿菌≥3.0億·g-1，有機質(zhì)≥40%的生物有機肥4800kg·hm-2做基肥，具體可根據(jù)施用地塊本身含有肥料的情況而定。

表 2 百脈根抗逆分子生物學(xué)改良研究Table 2 Molecular biological studies to improve L. corniculatus

4 百脈根分子生物學(xué)研究存在的不足

4.1 重視程度欠缺

1939-2018年，從Web of Science檢索到國內(nèi)外文獻(xiàn)共7 233條結(jié)果，從中國知網(wǎng)檢索到738條結(jié)果，其中中文文獻(xiàn)477條，外文文獻(xiàn)261條。對百脈根逐年文獻(xiàn)量進(jìn)行統(tǒng)計分析：中國知網(wǎng)和Web of Science數(shù)據(jù)庫收集的以“百脈根”為主題的文獻(xiàn)量呈逐年遞增趨勢，這說明百脈根在國際上仍舊屬于研究的熱門話題；自2000年起，國內(nèi)不少的科研學(xué)者才加深了百脈根的探索研究，相比國際而言，我國起步明顯落后于其他國家(圖1、表3)。

圖 1 1948-2018年百脈根逐年文獻(xiàn)變化量Figure 1 L. corniculatus literature trend from 1948 to 2018

表 3 百脈根文獻(xiàn)主要國家占比量Table 3 The distribution of L. corniculatus studies by country

對Web of Science檢索到的7 233條百脈根相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分類發(fā)現(xiàn)，我國共發(fā)表了121篇文章，占據(jù)總文獻(xiàn)的1.67%。通過中國知網(wǎng)檢索豆科牧草-苜蓿的文獻(xiàn)量，共檢索到了31 906條結(jié)果。分析認(rèn)為，百脈根作為飼草質(zhì)量較高的植物，應(yīng)該受到國內(nèi)科研工作者進(jìn)一步的重視。此外通過中國知網(wǎng)對百脈根的研究領(lǐng)域進(jìn)行了計量統(tǒng)計。發(fā)現(xiàn)在對百脈根的研究當(dāng)中，分子生物學(xué)和基因工程方面的研究占據(jù)比例較重，但是對如何加大百脈根資源利用和應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)提高產(chǎn)量方面的研究卻少之又少，筆者認(rèn)為百脈根作為一種優(yōu)良的豆科牧草，應(yīng)該加大對百脈根的畜牧養(yǎng)殖、園林綠化和草地改良等方面的研究，為百脈根的大田應(yīng)用提供充足的理論依據(jù)。

4.2 生物技術(shù)領(lǐng)域的研究亟待加強

目前，百脈根在育種方面主要分為傳統(tǒng)育種和分子育種。利用傳統(tǒng)育種手段對百脈根進(jìn)行育種會發(fā)現(xiàn)育種周期長、雜交操作困難、坐果率低、自交衰退等現(xiàn)象，此外傳統(tǒng)育種手段往往依賴于實驗人員的經(jīng)驗，具有很大的盲目性和不可預(yù)測性。近年來隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，利用分子育種技術(shù)對百脈根進(jìn)行優(yōu)良性狀的篩選，不僅僅能夠顯著提高育種效率還能夠大大縮短育種周期，成為百脈根育種的重要手段?，F(xiàn)如今轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)在百脈根育種方面取得了重大成果，與此同時也發(fā)現(xiàn)了很多不足之處。

2.2.2 縮合單寧對腸道吸收的影響

2)優(yōu)良基因的篩選。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有4類轉(zhuǎn)錄因子與植物的抗逆性相關(guān)，分別是bZIP類、AP2/ERF類、MYB類和WRKY類，通過在其他植物上進(jìn)行篩選驗證，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量抗逆功能較強的基因，但目前僅僅發(fā)現(xiàn)了對AP2/ERF類在百脈根進(jìn)行部分轉(zhuǎn)化驗證，因此其他與抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子仍需不斷去探索驗證，以篩選出最優(yōu)基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

3)遺傳穩(wěn)定性。單一基因構(gòu)建載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)成為常規(guī)手段，將多個優(yōu)良基因進(jìn)行載體的構(gòu)建進(jìn)行轉(zhuǎn)化能夠大大提高百脈根的抗逆性，但在多價基因轉(zhuǎn)化過程，由于百脈根的自身抵御機制和嵌合體問題，會存在基因丟失問題，從而大大影響百脈根的抗逆性，因此，針對多價共聚體轉(zhuǎn)化百脈根仍需不斷去探索和優(yōu)化。

(3) 發(fā)動機航行速度增大時, 發(fā)動機的比沖先增大后減小. 此外, 發(fā)動機內(nèi)部氣相的體積分?jǐn)?shù)分布情況也與航行速度有關(guān).

目前市場啟動遲緩的現(xiàn)狀比較普遍，各大廠商為了在多雨季節(jié)里盡快銷納掉庫存，避免旺季到來的時候物流過于集中，可以說是費盡了心思考慮如何才能盡快將囤貨鋪向市場。于是，各大廠家都不約而同地推出了“提貨返還”等優(yōu)惠政策。最近更是掀起了一波“先玩后買”的熱潮，但事實上廠家這些營銷政策的推出，并沒能真正改變肥市的疲軟常態(tài)。究其原因，主要還是受天氣影響，農(nóng)作物受災(zāi)情況較為嚴(yán)重。據(jù)記者調(diào)查了解，近兩個月內(nèi)，湖南、山東、江蘇、安徽等多個省份農(nóng)作物都受到了臺風(fēng)不同程度的破壞。

篩選標(biāo)記基因的安全性。篩選標(biāo)記基因雖然大幅度提高了百脈根篩選過程的簡便性，同時也會帶來一定的隱患：1)是否會影響外源基因的成功表達(dá)；2)限制了多個基因的同時轉(zhuǎn)化；3)篩選標(biāo)記是否會影響轉(zhuǎn)基因百脈根的農(nóng)藝性狀。因而構(gòu)建無刪選標(biāo)記基因的載體顯得尤為重要。

除此之外，百脈根根瘤信號共生轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中各個基因的生化功能和相互關(guān)系，縮合單寧如何在蛋白質(zhì)降解過程中發(fā)揮功能等研究都處于初步階段。隨著生物信息學(xué)水平的不斷提高，分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展以及百脈根全基因組測序的完成，應(yīng)該會有更多全新的有意義的科研成果不斷誕生。

測控專業(yè)補充標(biāo)準(zhǔn):測控專業(yè)的專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)側(cè)重于評估是否真正意義上做到培養(yǎng)學(xué)生的專業(yè)素質(zhì)素養(yǎng)的要求。上海理工大學(xué)自建校來,一直秉持著以教育為主,科研為輔,科研成果是為教育教學(xué)服務(wù)的辦學(xué)理念。學(xué)校有長期對口合作的企業(yè),長期派遣教師到企業(yè)掛職鍛煉,并定期安排學(xué)生前往企業(yè)實習(xí),聘請商界人士來學(xué)校進(jìn)行講座或授課以及經(jīng)驗交流,有意識地縮小理論課程與實際企業(yè)需求間的差距,致力于培養(yǎng)符合社會發(fā)展需求的優(yōu)秀工程型人才。

4.3 全基因組信息有待完善

2008年日本公布了基于二代測序技術(shù)的日本百脈根(L. japonicus)基因組序列，但其組裝質(zhì)量較差：基因組覆蓋度為67%，定位到染色體的比例僅為28%，因此序列不完整、片段化，缺少復(fù)雜的重復(fù)區(qū)域，且基因注釋不完全等，這些存在的問題嚴(yán)重限制了對百脈根的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究。擬南芥(Arabidopsis thaliana)的許多同源基因在百脈根基因組中是不完整或找不到的。例如在百脈根中發(fā)現(xiàn)了很多不完整片段的PIN蛋白家族成員，因不知這些片段真?zhèn)危虼藷o法確定PIN蛋白家族成員的數(shù)量和序列；從百脈根中分離出70多個NFP家族成員，其中30多個成員沒有完整的蛋白序列；比較基因組分析蝶形亞科的全基因組復(fù)制事件(WGD)，共有1 160個WGD事件，而在百脈根中僅分析出395個WGD事件；此外，百脈根的著絲粒結(jié)構(gòu)遺留不清楚，存在大量的gap。由此可見，采用三代或四代測序技術(shù)提供高質(zhì)量的百脈根基因組圖譜已勢在必行。

5 百脈根分子生物學(xué)研究展望

1) 對百脈根特異性指紋圖譜和種質(zhì)資源圃的建立不僅能夠保存百脈根種質(zhì)的資源多樣性，創(chuàng)建百脈根品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫，還能夠為百脈根種質(zhì)資源管理，優(yōu)良品種選育以及生物學(xué)研究提供優(yōu)越的科學(xué)依據(jù)。

2) 構(gòu)建多價、無刪選標(biāo)記基因的表達(dá)載體，促使基因的同時表達(dá)，可加強基因表達(dá)產(chǎn)物在功能上的協(xié)同性。此外，通過對高蛋白基因、固氮基因、抗病蟲基因、耐旱耐鹽抗逆性等基因的研究探索，篩選優(yōu)良基因進(jìn)行百脈根的遺傳轉(zhuǎn)化，可以培育出更加優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的牧草百脈根新品系。

3) 隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷深入，探索提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的方法已經(jīng)可以得到實現(xiàn)，目前已有科研人員解析了半胱氨酸提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米(Zea mays)幼胚轉(zhuǎn)化效率的機理。因而，建立快速、高效的百脈根遺傳轉(zhuǎn)化體系條件已經(jīng)完全成熟。

4) 基于三代測序的SMRT技術(shù)開發(fā)不斷加深，基于其低廉的成本、快速的數(shù)據(jù)讀取速度和較高的應(yīng)用潛能，必能在百脈根在基因挖掘、功能分析以及分子標(biāo)記育種等方面提供更加精準(zhǔn)的技術(shù)支持。

總而言之，針對我國飼草作物研究基礎(chǔ)相對薄弱，草業(yè)研究局限在傳統(tǒng)育種、生理研究等領(lǐng)域的研究背景，圍繞國家“糧改飼”、大力發(fā)展草牧業(yè)等政策方針，通過現(xiàn)代生物技術(shù)對百脈根進(jìn)行分子和細(xì)胞水平上的設(shè)計和操作，加速物種內(nèi)基因資源的優(yōu)化，打破物種之間遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移交換的天然屏障，從而定向地改進(jìn)飼草作物的產(chǎn)量、質(zhì)量和抗逆性，提高草資源的利用效率，必將會極大地促進(jìn)草地畜牧業(yè)發(fā)展，促進(jìn)我國的綠化和生態(tài)建設(shè)。