KAI1基因轉(zhuǎn)染對乏氧培養(yǎng)下胰腺癌MiaPaCa-2細胞增殖、遷移及VEGF表達的影響

劉旭 郭曉鐘 李宏宇 陳江 許文達

·論著·

KAI1基因轉(zhuǎn)染對乏氧培養(yǎng)下胰腺癌MiaPaCa-2細胞增殖、遷移及VEGF表達的影響

劉旭 郭曉鐘 李宏宇 陳江 許文達

目的觀察轉(zhuǎn)染KAI1基因的人胰腺癌MiaPaCa-2細胞在乏氧條件下培養(yǎng)后細胞增殖、遷移、侵襲能力的變化，探討其可能機制。方法應(yīng)用KAl1基因過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乏氧條件培養(yǎng)后的人胰腺癌MiaPaCa-2細胞，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測轉(zhuǎn)染細胞KAI1、VEGF-C、VEGF-A蛋白的表達，四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測轉(zhuǎn)染細胞的增殖，細胞劃痕及Transwell小室實驗觀察轉(zhuǎn)染細胞的遷移及侵襲能力，酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測培養(yǎng)上清液中人VEGF-C、VEGF-A含量。結(jié)果轉(zhuǎn)染KAI1基因后的MiaPaCa-2-K細胞的KAI1蛋白表達量較未轉(zhuǎn)染細胞顯著增加[(0.549±0.021)比0]。乏氧條件培養(yǎng)后轉(zhuǎn)染細胞的增殖無明顯變化，但它的遷移距離明顯縮短，穿膜細胞數(shù)顯著減少[(14.0±5.8)比(43.0±14.4)個，P<0.05]；細胞的VEGF-C表達顯著降低[(0.218±0.043)比(0.745±0.069)。P<0.05]，但VEGF-A表達變化不顯著；細胞培養(yǎng)上清液中VEGF-C含量顯著減少[(1236±247)比(2045±221)pg/ml，P<0.01]。結(jié)論轉(zhuǎn)染KAl1基因的MiaPaCa-2細胞在乏氧條件下培養(yǎng)后的細胞遷移、侵襲能力減弱，其機制可能是通過下調(diào)VEGF-C的表達來抑制胰腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的。

胰腺腫瘤； 缺氧； 細胞增殖； 細胞運動； 血管內(nèi)皮生長因子類； KAI1基因

【Keywrods】 Pancreatic neoplasms； Anoxia； Cell proliferation; Cell movement; Vascular endothelial growth factors; KAI1 gene

早期即發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移是胰腺癌重要特征和預(yù)后極差的重要因素[1]。早期胰腺癌組織常處于乏氧狀態(tài)，乏氧狀態(tài)下胰腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移明顯活躍[2]，因此，乏氧狀態(tài)可能促進了胰腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移。KAI1基因是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其對胰腺癌的遷移、侵襲、自噬均具有調(diào)節(jié)作用。近期研究結(jié)果顯示，在乏氧狀態(tài)下KAI1是一種重要的乏氧靶基因[3]。本研究將插入KAI1基因的真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胰腺癌MiaPaCa-2細胞，觀察乏氧條件培養(yǎng)后細胞增殖、遷移、侵襲能力及VEGF蛋白表達的變化，探討KAI1基因調(diào)控胰腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的可能作用及機制。

材料和方法

一、KAl1基因轉(zhuǎn)染

MiaPaCa-2細胞株為沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科保存。攜帶人KAI1全長cDNA的真核表達質(zhì)粒(pCMV-KAI1) 由本研究組前期構(gòu)建[4-5]。在完全密閉的方盒中持續(xù)通入由乏氧設(shè)備產(chǎn)生的乏氧氣體(1% O2、5% CO2和94% N2)，將處于對數(shù)生長期的MiaPaCa-2細胞在乏氧環(huán)境中培養(yǎng)1周后接種到6孔板。采用Lipofectamine 2000(美國Invotrogen公司)將pCMV-KAI1轉(zhuǎn)染MiaPaCa-2細胞，經(jīng)G418篩選后擴增培養(yǎng)。以轉(zhuǎn)染pCMV空質(zhì)粒及未轉(zhuǎn)染細胞作為對照。

二、蛋白質(zhì)印跡法

收集各組對數(shù)生長期的2×106個細胞，裂解并收集細胞總蛋白，采用BCATM蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量。采用常規(guī)蛋白質(zhì)印跡法檢測KAI1蛋白及VEGF-C、VEGF-A蛋白的表達。各種抗體均購自美國Santa Cruz公司，以β-actin作為內(nèi)參，采用Quantity One軟件(BioRad)測定蛋白條帶的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值表示蛋白表達量。

三、四甲基偶氮唑藍(MTT)法

將各組對數(shù)生長期細胞調(diào)整密度至1×104個/ml，取200 μl細胞懸液接種入96孔細胞培養(yǎng)板。分別培養(yǎng)24、48、72、96 h，每組每個時間點設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)到時間點時，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入150 μl DMSO振蕩10 min。在酶標儀上檢測各孔490 nm波長處的吸光值(A490值)，以只含培養(yǎng)液并加入150 μl DMSO的空白對照孔調(diào)零，繪制細胞生長曲線。

四、Transwell小室侵襲實驗

將對數(shù)生長期的各組細胞用無血清DMEM調(diào)整到密度為1×105個/ml。在Transwell小室(美國Costar公司)的上室加入細胞懸液100 μl，下室加入600 μl含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。每組設(shè)3個小室。在乏氧條件下培養(yǎng)12 h。取出小室，用PBS淋洗，用棉簽輕輕刮除上室中未遷移的細胞，固定、染色、計算穿膜細胞數(shù)并拍照。實驗重復(fù)3次。

五、細胞劃痕實驗

收獲對數(shù)生長期的各組細胞，調(diào)整細胞密度至1×105個/ml，接種于6孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔。乏氧條件下培養(yǎng)至細胞呈單層，以移液器槍頭在培養(yǎng)孔底部呈“1”型劃過。以無血清DMEM培養(yǎng)液洗滌以棄去漂浮細胞，更換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)24、48、72 h后鏡下觀察細胞爬過劃痕的情況并拍照。實驗重復(fù)3次。

六、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法

取對數(shù)生長期細胞，以每孔1×105個細胞接種于12孔板中。乏氧條件培養(yǎng)下細胞貼壁生長24 h，收集細胞培養(yǎng)上清液，離心取上清液。在VEGF-C酶聯(lián)免疫試劑盒(美國Ray Bio公司)提供的已標記的ELISA酶標板的各孔先加入樣品稀釋液40 μl，然后再將待測樣品10 μl加于酶標板底部(最終稀釋度為5倍)。按試劑盒說明書操作。以空白孔調(diào)零，測定各孔450 nm波長的吸光值(A450值)。

七、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)染細胞的鑒定

未轉(zhuǎn)染的MiaPaCa-2細胞和空載體轉(zhuǎn)染細胞(MiaPaCa-2-p)均無KAI1蛋白表達，轉(zhuǎn)染pCMV-KAI1的MiaPaCa-2細胞(MiaPaCa-2-K)的KAI1蛋白表達量為0.549±0.021(圖1)，提示成功構(gòu)建了KAI1基因高表達的MiaPaCa-2細胞株。

圖1 各組MiaPaCa-2細胞的KAI1蛋白表達

二、乏氧條件培養(yǎng)下各組細胞的增殖狀況

在乏氧環(huán)境中培養(yǎng)24、48、72、96 h后，MiaPaCa-2細胞的A490值分別為0.18、0.20、0.39、0.44；MiaPaCa-2-p細胞為0.17、0.19、0.36、0.46，MiaPaCa-2-K細胞為0.16、0.17、0.33、0.41。3組細胞的增殖速度無明顯差異(圖2)。

圖2 各組MiaPaCa-2細胞的生長曲線

三、乏氧條件培養(yǎng)下各組細胞的遷移能力

MiaPaCa-2-K 組細胞的遷移距離較MiaPaCa-2及MiaPaCa-2-p細胞均短(圖3)。

四、乏氧條件培養(yǎng)下各組細胞的侵襲能力

MiaPaCa-2、MiaPaCa-2-p、MiaPaCa-2-K組的穿膜細胞數(shù)分別為(43.0±14.4)、(48.0±12.6)、(14.0±5.8)個(圖4)，MiaPaCa-2-K組的穿膜細胞數(shù)較MiaPaCa-2-p組及MiaPaCa-2組均顯著減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為10.67、12.85，P值均<0.05)。

圖3 各組MiaPaCa-2細胞的遷移情況(×100)

圖4 各組MiaPaCa-2細胞的穿膜細胞(×200)

五、乏氧條件培養(yǎng)下各組細胞VEGF-C、VEGF-A蛋白表達

MiaPaCa-2、MiaPaCa-2-p、MiaPaCa-2-K細胞VEGF-C表達量分別為0.745±0.069、0.687±0.087、0.218±0.043，VEGF-A表達量分別為0.389±0.073、0.385±0.067、0.365±0.058(圖5)。MiaPaCa-2-K組細胞的VEGF-C表達較其他兩組細胞顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為13.12、11.65，P值均<0.05)，但各組間VEGF-A的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5 各組MiaPaCa-2細胞的VEGF-A、VEGF-C蛋白表達

MiaPaCa-2、MiaPaCa-2-p、MiaPaCa-2-K細胞培養(yǎng)上清液中VEGF-C含量分別為(2045±221)、(2163±239)、(1236±247)pg/ml，MiaPaCa-2-K組細胞顯著低于其他兩組(t值分別為11.36、10.93，P值均<0.01)。

討 論

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的顯著特點，淋巴轉(zhuǎn)移是重要的腫瘤轉(zhuǎn)移途徑之一。由于毛細淋巴管的管腔大而不規(guī)則(直徑10～60 μm)，管壁僅由一層淋巴內(nèi)皮細胞和極薄的結(jié)締組織構(gòu)成，且其主要功能是可根據(jù)組織內(nèi)壓調(diào)節(jié)細胞間的連接以容許液體及大分子物質(zhì)通過[6]，因此，毛細淋巴管具有比毛細血管更大的通透性，癌細胞也更容易進入毛細淋巴管發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。

KAI1基因編碼的蛋白質(zhì)CD82屬Ⅲ型膜蛋白的4次跨膜超家族(transmembrane 4 su perfamily，TM4SF)[6]，具有4個高度保守的疏水跨膜結(jié)構(gòu)(TM1-4)、一個近N端小的細胞外環(huán)(extracellular loops1，EC1)和一個近C端大的細胞外親水環(huán)狀結(jié)構(gòu)(EC2)。該結(jié)構(gòu)平行于細胞膜，也決定了該蛋白功能的特異性。它可介導(dǎo)包括細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)等在內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在細胞的聚集、粘附、遷移、增殖過程中具有一定的調(diào)節(jié)作用。本研究組以往的研究發(fā)現(xiàn)，早期胰腺癌(Ⅰ、Ⅱ期) KAI1 mRNA表達顯著高于伴有淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移的晚期胰腺癌(Ⅲ、Ⅳ期)，KAI1基因高表達顯著抑制細胞的侵襲能力[7]。細胞內(nèi)1-磷酸鞘氨醇(S1P)的產(chǎn)生是由鞘氨醇激酶(SPK)催化生成的，而SPK信號通路與細胞遷移密切相關(guān)。高表達KAI1基因的胰腺癌細胞S1P的合成降低，因此推測KAI1基因具有抑制胰腺癌細胞SPK活性的作用，并抑制胰腺癌細胞遷移[5]。本研究在乏氧條件下培養(yǎng)人胰腺癌細胞MiaPaCa-2，結(jié)果顯示 KAI1基因的高表達對細胞增殖作用不明顯，但可顯著抑制癌細胞的遷移，可能是其抑制淋巴轉(zhuǎn)移的重要機制之一。

相關(guān)研究顯示，部分VEGF家族成員和受體信號通路在淋巴管新生和淋巴轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵性作用。并已證實胰腺癌細胞可以合成并釋放VEGF-C、VEGF-A等因子[8-9]，刺激淋巴管內(nèi)皮細胞增殖，趨化其向病變部位遷移[10]，最終促進腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，在乏氧條件培養(yǎng)下KAI1高表達對胰腺癌MiaPaCa-2細胞VEGF-A的表達無明顯作用，但顯著抑制了VEGF-C的表達及其在培養(yǎng)上清中的含量，提示KAI1基因抑制淋巴轉(zhuǎn)移的作用可能是通過下調(diào)VEGF-C表達來實現(xiàn)的。

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EffectsofKAl1genetransfectiononproliferation,migration,invasionandVEGFexpressionofpancreaticcancerMiaPaCa-2cellsunderhypoxiccondition

LIUXu,GUOXiao-zhong,LIHong-yu,CHENJiang,XUWen-da.

DepartmentofGastroenterology,GeneralHospitalofShenyangMilitaryAreaCommand,Shenyang110016,China

GUOXiao-zhong,Email：guoxiaozhong1962@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of KAll gene transfection on proliferation, migration, invasion and VEGF expression of pancreatic cancer MiaPaCa-2 cells under hypoxic condition, and explore possible mechanism.MethodsThe pcMV-KAI1 vector which contained the full length of KAI1 cDNA was transfected into pancreatic cancer cells MiaPaCa-2, and KAI1, VEGF C, VEGF A protein expressions were determined by Western blot. The proliferation of pancreatic cancer cells was evaluated by MTT method. Wound-healing assay and cell invasion assay were used to detect the migration and invasion of pancreatic cancer cells. The expression of VEGF C, VEGF A in supernatant of culture was measured by ELISA method.ResultsThe expression of KAI1 protein in MiaPaCa-2 K transfected with KAI1 was significantly higher than that in non-transfected cells [(0.549±0.021)vs0,P<0.05]. The proliferation under hypoxic condition was not significantly different, but the migration distance was significantly shorter and the number of transmembrane cell was significantly decreased [(14.0±5.8)vs(43.0±14.4),P<0.05]. The expression of VEGF-C in cell was significantly decreased [(0.218±0.043)vs(0.745±0.069),P<0.05], but the expression of VEGF-A was not significantly different; the expression of VEGF-C in cell culture supernatants was significantly decreased [(1236±247)vs(2045±221)pg/ml,P<0.01].ConclusionsThe migration, invasion ability of pancreatic cancer MiaPaCa-2 cells with KAll transfection under hypoxic condition is decreased, and the possible mechanism of inhibiting lymphatic metastasis is down-regulation of VEGF-C expression.

2013-06-24)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.003

國家自然科學(xué)基金(81071982)

110016 遼寧沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科

郭曉鐘，Email: guoxiaozhong1962@163.com