先天性高胰島素血癥四例ABCC8基因突變分析

桑艷梅 張亞楠 劉敏 閆潔

·短篇論著·

先天性高胰島素血癥四例ABCC8基因突變分析

桑艷梅 張亞楠 劉敏 閆潔

先天性高胰島素血癥(congenital hyperinsulinism, CHI)是嬰兒持續(xù)性、復發(fā)性低血糖的主要原因之一，迄今已發(fā)現(xiàn)了8種遺傳學類型。ATP敏感性鉀通道型先天性高胰島素血癥(KATP-CHI)是CHI最嚴重和最常見的類型，約占CHI患兒的40%～45%，其中82%的患兒對二氮嗪治療無效[1-2]。ATP 結合暗盒蛋白家族C8(ATP-binding cassette subfamily C 8, ABCC8)基因編碼的磺脲受體1(SUR1)是CHI最主要的致病基因，迄今已發(fā)現(xiàn)了150多種突變[3]。其遺傳方式多為常染色體隱性遺傳，少數(shù)為常染色體顯性遺傳，偶見新生突變。國外研究資料顯示不同類型的ABCC8基因突變臨床表現(xiàn)有著較大的異質性。本研究運用分子生物學技術對4例CHI患兒家系的ABCC8基因的39個外顯子區(qū)進行測序，以期揭示CHI的致病機制。

一、材料與方法

1．一般資料：4例臨床診斷為CHI患兒的一般情況見表1。2例患兒為足月適于胎齡兒，2例患兒為巨大兒。4例患兒母親在孕期均體健，均無糖耐量異常病史，均無低血糖及糖尿病家族史。胰腺影像學檢查均未見異常。

表1 4例CHI患兒臨床資料及二氮嗪治療的療效

2．治療經(jīng)過：3例患兒確診后曾予以二氮嗪為期7～10 d的試驗性治療，當二氮嗪增加至15 mg·kg-1·d-1時3例患兒仍表現(xiàn)頻繁發(fā)作的低血糖，提示該3例患兒對二氮嗪治療無效，故予以停用。其中病例1經(jīng)知情同意后轉入外科進行了胰腺次全切除術治療，術后血糖恢復至正常水平，經(jīng)長期隨訪，胰腺內、外分泌功能正常。病例2和3繼續(xù)予以多餐喂養(yǎng)、喂食葡萄糖等內科非手術治療。病例4應用奧曲肽治療1個多月，患兒血糖控制良好，但因奧曲肽價格昂貴，予以停用，改用多餐喂養(yǎng)及喂食葡萄糖等內科治療。

3．遺傳學分析：分別留取4例CHI患兒家系的外周血，用promega公司基因組提取試劑盒提取基因組DNA。利用primer premier 5.0軟件設計用于擴增ABCC8基因39個外顯子區(qū)的相應引物。PCR反應體積： 5×GoTaq緩沖液10 μl，2.0 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTP，上下游引物各1 μmol/L，1.25 U熱啟動Taq酶(Promega公司)，總體積50 μl。PCR程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s、62～64℃(ABCC8及KCNJ11基因)或58～62℃(GLUD1基因)30 s、72℃ 45 s，循環(huán)38次，最后72℃延長5 min。PCR產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收(Tiangen公司凝膠回收試劑盒)，純化，送北京英俊公司(Invitrogen)測序。本項研究獲得醫(yī)院倫理委員會的批準，并于抽血前獲得患兒父母的知情同意。

二、結果

病例3患兒及其母親ABCC8基因的第29外顯子區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個c.3650 G>A雜合突變，患兒父親該位點基因型正常(G/G)，該突變的遺傳方式為母系常染色體顯性遺傳。該突變導致編碼產物第1217位氨基酸性質由精氨酸(R)變?yōu)橘嚢彼?K，圖1)。該突變既往文獻未見報道。

圖1 病例3 ABCC8基因測序圖

病例4患兒及其父親ABCC8基因的第37外顯子區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個c.4487 G>A雜合突變，患兒母親該位點的基因型正常，該突變的遺傳方式為父系遺傳。該突變導致編碼產物第1493位氨基酸殘基由精氨酸(R)突變?yōu)楣劝滨?Q，圖2)。該突變曾有文獻報道。

圖2 病例4 ABCC8測序圖

討論ABCC8基因突變是第一個被發(fā)現(xiàn)與CHI有關的基因，也是CHI最常見的致病基因。ABCC8基因由39個外顯子組成，長度超過100 kb，編碼1582個氨基酸，核酸重約177 000。位于染色體11p15.1。

本研究4例CHI患兒中1例為ABCC8基因第29外顯子區(qū)G>A雜合突變，為母系常染色體顯性遺傳，既往文獻未見報道,提示其為罕見的ABCC8突變類型。常染色體顯性遺傳基因突變所致的KATP-CHI臨床上相對少見，其遺傳方式包括父系遺傳及母系遺傳[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，由母系遺傳的ABCC8突變所致的CHI患兒臨床癥狀較輕，由于二氮嗪可結合正常的SUR1亞單位形成雜聚鈦復合體或有足夠的正常鉀離子通道，所以該類患兒多對藥物治療有效，經(jīng)不同時間的治療后患兒的低血糖癥狀多可緩解或消失，從而避免了胰腺切除術所引起的一系列不良反應及并發(fā)癥的發(fā)生[5]。

本研究中1例為ABCC8基因第37外顯子區(qū)G>A雜合突變，為父系常染色體顯性遺傳，既往文獻已有報道。國外研究資料顯示：父系遺傳的ABCC8基因突變包括了下列兩種可能性：(1)父系遺傳的常染色體顯性遺傳基因突變，即父親和患兒均攜帶同樣的突變，患兒母親突變位點的基因型正常。該類突變CHI的組織學類型為彌散型?；純号R床癥狀輕重不一，起病年齡偏早，且多對二氮嗪等藥物治療無效，需行不同程度的胰腺切除術來控制低血糖的發(fā)生[6]。(2)常染色體隱性遺傳基因突變的特殊類型，即體細胞父系ABCC8突變伴胰腺病灶內母系染色體片段(11p15)缺失，該丟失的染色體區(qū)域內含有β細胞鉀通道ABCC8和KCNJ11基因和印記的腫瘤抑制基因。這種特殊的基因組合造成受影響的β細胞中突變基因半合子數(shù)目減少和細胞生長的不平衡，最終導致局灶型KATP-CHI[7]。該型患兒多存在鉀通道構成的異常，病情較重，多于新生兒期發(fā)病，出生體重多為巨大兒，患兒于出生后幾天內即表現(xiàn)出嚴重而持續(xù)性的低血糖癥，需要大量的葡萄糖維持血糖的正常，還常伴有低血糖引起的抽搐、驚厥、肌張力低下、喂養(yǎng)困難、呼吸暫停等；多對二氮嗪等藥物治療無效、需行不同程度的胰腺切除術來控制低血糖的發(fā)生[8]。本研究中1例于生后4個月起病，出生體重正常，對二氮嗪治療無效，提示其為常染色體顯性遺傳基因突變所致的KATP-CHI可能性大。按照國外經(jīng)驗，對此類患兒應進一步行18F-L-Dopa PET SCAN 等影像學檢查協(xié)助組織學分型，以制訂下一步的治療方案。但目前國內尚未開展此項技術，使該類患兒的組織學分型及外科手術方式的選擇等方面均面臨一定的困難[9]。

奧曲肽是一種人工合成的生長抑素類似物，是胰島素釋放的強效抑制劑，可從多因素調控胰腺β細胞的功能，在國外經(jīng)常應用于對二氮嗪治療無效的CHI患兒[10]。本研究中病例4應用奧曲肽試驗性治療，結果患兒對奧曲肽治療有效，患兒血糖控制良好，無明顯不良反應。上述結果提示，攜帶ABCC8 R1493Q突變的患兒對奧曲肽治療有效，可長期應用該類藥物進行內科治療，從而防止低血糖的發(fā)生。但奧曲肽需要皮下給藥、價格昂貴，其在國內二氮嗪治療無效患兒中的應用受到一定限制。

ABCC8基因突變根據(jù)功能的不同可分為兩種類型：Ⅰ型突變(classⅠ)，它通過蛋白的完全丟失或交通缺陷導致細胞表面鉀通道表達的減少；Ⅱ型突變(classⅡ)，它破壞了MgADP刺激鉀通道活化的能力，因此阻止了鉀通道被代謝抑制所誘導的活化，該類突變患兒的鉀通道蛋白正常存在，KATP通道卻處于關閉狀態(tài)。其中以I型突變導致的臨床表型更為嚴重。某些Ⅱ型突變由于鉀通道對MgADP有部分反應,臨床癥狀可表現(xiàn)較輕。本研究病例3攜帶的R1217K突變位于ABCC8基因的第29外顯子區(qū)，病例4攜帶的R1493Q突變位于ABCC8基因的第37外顯子區(qū)，其具體突變類型及致病機制尚不明確，有待進一步的功能表達研究來證實。

總之，作為CHI的主要類型KATP-CHI有著復雜的致病機制，不同的ABCC8突變類型所致的CHI臨床表型存在一定的異質性。隨著研究的不斷深入，將有更多的鉀通道致病基因被發(fā)現(xiàn)，這對于KATP-CHI遺傳發(fā)病機制的闡明及治療策略的制訂有著重要的理論意義。

[1] Arnoux JB，de Lonlay P， Ribeiro MJ，et al. Congenital hyperinsulinism. Early Hum Dev, 2010,86：287-294.

[2] Saint-Martin C, Arnoux JB, de Lonlay P, et al.KATP channel mutations in congenital hyperinsulinism.Semin Pediatr Surg, 2011，20:18-22.

[3] James C, Kapoor RR, Ismail D, et al.The genetic basis of congenital hyperinsulinism.J Med Genet, 2009，46:289-299.

[4] Pinney SE, MacMullen C,Becker S,et al. Clinical characteristics and biochemical mechanisms of congenital hyperinsulinism associated with dominant KATP channel mutations.J Clin Invest, 2008, 118:2877-2886.

[5] Arnoux JB, Verkarre V, Saint-Martin C, et al. Congenital hyperinsulinism: current trends in diagnosis and therapy.Orphanet J Rare Dis. 2011,6:63.

[6] Pinney SE, MacMullen C, Becker S, et al.Clinical characteristics and biochemical mechanisms of congenital hyperinsulinism associated with dominant KATP channel mutations. J Clin Invest, 2008,118: 2877-2886.

[7] Bellanné-Chantelot C, Saint-Martin C, Ribeiro MJ, et al.ABCC8 and KCNJ11 molecular spectrum of 109 patients with diazoxide-unresponsive congenital hyperinsulinism.J Med Genet, 2010,47:752-759.

[8] Henwood MJ, Kelly A, Macmullen C, et al.Genotype-phenotype correlations in children with congenital hyperinsulinism due to recessive mutations of the adenosine triphosphate-sensitive potassium channel genes. J Clin Endocrinol Metab, 2005,90:789-794.

[9] Barthlen W, Blankenstein O, Mau H, et al. Evaluation of (18F) fluoro-L-DOPA position emission tomography-computed tomography for surgery in focal congenital hyperinsulinism. J Clin Endocrinol Metab,2008, 93:869-875.

[10] De Leon DD, Stanley CA.Mechanism of disease: Advances in diagnos is and treatment of hyperinsulinism in neonates.Nat Clin Pract Endocrinol Metab,2007,3: 57- 68.

2013-04-03)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.015

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