促紅細(xì)胞生成素的神經(jīng)保護(hù)作用

劉 欣，吳海琴 綜述

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710004)

促紅細(xì)胞生成素(Erthropoietin，EPO)是由腎皮質(zhì)腎小管周?chē)g質(zhì)細(xì)胞和肝臟分泌的一種激素樣物質(zhì)，因其影響造血系統(tǒng)使紅細(xì)胞增多被人們廣泛認(rèn)識(shí)并應(yīng)用于臨床。近年來(lái)大量研究結(jié)果證實(shí)，EPO 是一種多功能營(yíng)養(yǎng)因子，功能性的EPO 受體在許多組織和器官中都有表達(dá)，包括神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，而且對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有重要保護(hù)作用。作者主要對(duì)EPO 的神經(jīng)保護(hù)作用及其作用機(jī)制進(jìn)行總結(jié)，并且對(duì)其未來(lái)在神經(jīng)系統(tǒng)的臨床應(yīng)用進(jìn)行展望。

1 EPO 及EPO-R(erythropoietin receptor)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)及在神經(jīng)系統(tǒng)的分布

EPO 是一種糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約34×103，含有2個(gè)二硫鍵，一個(gè)碳末端的精氨酸殘基，其編碼基因定位于染色體7q21-q22，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，有4個(gè)糖基化點(diǎn)。EPO-R 屬于細(xì)胞因子受體超家族成員，分子量為66kDa，由507個(gè)氨基酸組成的I 型跨膜糖蛋白，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。其中胞外區(qū)具有與其在細(xì)胞表面正確折疊和表達(dá)所必須的WSXWS 序列以及兩對(duì)半胱氨酸殘基，是與EPO 結(jié)合的區(qū)域，胞內(nèi)區(qū)具有2個(gè)保守的區(qū)域Box1 和Box2，對(duì)于EPO 與其受體結(jié)合有重要作用。EPO 在這兩個(gè)區(qū)域的作用下激活酪氨酸激酶-2 (janus tyrosine kinase 2，Jak2)，從而激活一系列激酶和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白而發(fā)揮生物學(xué)作用。

EPO 主要分布于循環(huán)血液中，是調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的主要因子。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)EPO 及其受體(EPO-R)除分布于循環(huán)血液中外，在人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物的大腦中也廣泛存在。Masuda［1］第一次證明EPO 受體存在于兩種神經(jīng)來(lái)源的嚙齒類(lèi)細(xì)胞系PC12 細(xì)胞和SN6 細(xì)胞中，同時(shí)他們［2］也證實(shí)了在試管內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生EPO，特別是在缺氧的狀態(tài)下更明顯。事實(shí)上，除肝和腎(分別為胎兒和成人主要的EPO 產(chǎn)生部位)外，已發(fā)現(xiàn)［3］另外兩個(gè)可以產(chǎn)生EPO 的部位:子宮和腦。在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中，應(yīng)該是在神經(jīng)管中最先發(fā)現(xiàn)EPO 受體的存在，而且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中EPO 及EPO-R 的表達(dá)隨著妊娠時(shí)間的增加而發(fā)生變化，出生后及成年人腦中發(fā)現(xiàn)EPO 及EPO 受體不僅在神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)也存在于其它細(xì)胞，如Cajal-Retzius 細(xì)胞和脈絡(luò)叢細(xì)胞，而且成年人腦中EPO 的量比造血組織中低30 倍［4］。最近，Shink，Kato 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)神經(jīng)元的情況下，缺氧可以導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)EPO 的mRNA 水平的表達(dá)，而且這與少突先驅(qū)膠質(zhì)細(xì)胞也存在著密切的關(guān)系。這些都表明EPO 在神經(jīng)發(fā)育及維持腦的穩(wěn)態(tài)中有重要作用。

2 EPO 的神經(jīng)保護(hù)作用

目前，大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，EPO 具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及神經(jīng)保護(hù)作用。有研究表明［6］在細(xì)胞及動(dòng)物水平上，EPO 具有逆轉(zhuǎn)抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體(Anti-ganglioside antibodies，Abs)的抑制神經(jīng)細(xì)胞重建的作用。為了測(cè)定EPO 的潛在治療作用，Mausberg 等［7］對(duì)試驗(yàn)性自身免疫神經(jīng)炎(experiment autoimmune neuritis，EAN)，例如吉蘭-巴雷綜合征 (Guillain-Barré syndrome，GBS)的動(dòng)物模型進(jìn)行EPO 干預(yù)發(fā)現(xiàn)，EPO 可以降低GBS 的嚴(yán)重程度及縮短疾病恢復(fù)的時(shí)間。這種神經(jīng)保護(hù)及神經(jīng)修復(fù)作用使得EPO 有望成為治療自身免疫神經(jīng)炎病，例如GBS 的有效藥物。

同時(shí)，有大量研究證實(shí)，EPO 在缺血缺氧模型中有重要的神經(jīng)保護(hù)作用。Chen 等［8］在小鼠腦缺血模型中觀察并證實(shí)，腦缺血導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶力下降，海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)型死亡和樹(shù)突棘丟失。通過(guò)EPO 治療能顯著提高腦缺血小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，減少腦缺血所致的海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元死亡和樹(shù)突棘丟失。Sargin 等［9］在轉(zhuǎn)基因小鼠模型上證明，在皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元上持續(xù)地激活EPO-R 的表達(dá)，可以增強(qiáng)小鼠的認(rèn)知功能。還有人［10］在兔蛛網(wǎng)膜下腔出血模型中觀察到，EPO 可以增加海馬正常神經(jīng)元的密度以及阻止蛛網(wǎng)膜下腔出血所導(dǎo)致的腦血管痙攣和神經(jīng)元損傷。在大鼠腦缺血再灌注損傷的模型中［11］，EPO 干預(yù)可以改善神經(jīng)功能評(píng)分，增多神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量，減輕損傷程度，對(duì)缺血側(cè)皮層的神經(jīng)細(xì)胞變性壞死有保護(hù)作用。

此外，轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明［12］，突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠暴露于3-硝基丙酸所致的多系統(tǒng)萎縮的模型中，EPO 治療可以保護(hù)多巴胺和紋狀體氨基丁酸投射區(qū)神經(jīng)元，從而改善運(yùn)動(dòng)功能。在大鼠脊髓損傷的模型中［13］，EPO 的介入可以通過(guò)阻止神經(jīng)元凋亡而保護(hù)神經(jīng)元，從而抵制谷氨酸對(duì)神經(jīng)元的毒性作用。有學(xué)者在創(chuàng)傷性腦損傷的模型中［14］發(fā)現(xiàn)，腹腔注射5000IU/kg 的EPO 1天或者3天都能降低海馬細(xì)胞丟失，增強(qiáng)損傷的皮質(zhì)及海馬的血管再生，最重要的是改善神經(jīng)功能，但是這種改善在腹腔注射3天這一組更明顯，提示3 倍量的EPO延緩給藥更能改善組織學(xué)和功能預(yù)后。還有學(xué)者［15］在大鼠癲癇模型上證明，EPO 可以調(diào)節(jié)癲癇的嚴(yán)重程度，保護(hù)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元，而且在大鼠帕金森模型上［16］也證實(shí)持續(xù)低劑量輸入EPO 可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。最近，Wu［17］等建立大鼠衰老模型，探討EPO 是否具有抗衰老作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中劑量的EPO 具有抗衰老作用，其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)抗氧化酶活性、提高抗氧化能力有關(guān)。從以上我們可以看出，EPO 對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用是多方面的，在各種動(dòng)物模型上已經(jīng)證實(shí)了EPO 的重要作用，提示EPO 有可能成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的有效藥物，對(duì)于后期的臨床研究有重要意義。

3 EPO 的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制

EPO 的神經(jīng)保護(hù)作用是通過(guò)多種途徑實(shí)現(xiàn)的。大量研究顯示，EPO 通過(guò)發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡、刺激新生血管生成、調(diào)節(jié)神經(jīng)元生成等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，而這些功能的發(fā)揮依賴(lài)EPO/EPO-R 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如圖1 所示［18］。該機(jī)制認(rèn)為，EPO-R 介導(dǎo)的EPO 生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮，依賴(lài)EPO 與EPO-R 結(jié)合后EPO 誘導(dǎo)Jak2 磷酸化，磷酸化后的Jak2 通過(guò)激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子STAT5 通路、磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinostid 3-kinase，PI3K)/AKT 通路、核因子NF-ΚB(nuclear factor，NF-ΚB)通路而發(fā)揮作用。

首先，研究發(fā)現(xiàn)，Jak2-STAT5 通路是EPO實(shí)現(xiàn)抗炎抗凋亡作用的重要通路。Zhang 等［19］通過(guò)對(duì)腦缺血后大鼠海馬CA1 區(qū)的STAT5 的觀察發(fā)現(xiàn)，腦缺血模型中，EPO組的磷酸化的STAT5 增加，而且海馬CA1 區(qū)的神經(jīng)元凋亡減弱，但當(dāng)加入Jak2 抑制劑后，這些作用被削弱了，這表明EPO 確實(shí)通過(guò)Jak2-STAT5 通路來(lái)發(fā)揮神經(jīng)元抗凋亡作用。然而Sola 等［20］對(duì)閉塞大腦中動(dòng)脈的7天齡大鼠的局灶性腦缺血模型觀察發(fā)現(xiàn)EPO 可以誘導(dǎo)使磷酸化的Jak2 及STAT5 明顯增多，而且Bcl-XL 的表達(dá)在腦缺血后1天也明顯上調(diào)，他們發(fā)現(xiàn)STAT5 進(jìn)入胞核后通過(guò)刺激Bcl-2 和Bcl-XL 抗凋亡基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生大量Bcl-2 和Bcl-XL 抗凋亡蛋白，從而阻止細(xì)胞色素C 從線(xiàn)粒體釋放，發(fā)揮抗凋亡作用，提示EPO 發(fā)揮其抗凋亡作用并不是通過(guò)某一條通路作用而實(shí)現(xiàn)的。Um 等［21］對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡模型的EPO-R 通路進(jìn)行觀察得到，在造血細(xì)胞，激活STAT5、AKT、MAPK 及其它通路中的任意一條即可以使細(xì)胞存活，但是EPO 在發(fā)揮神經(jīng)元抗凋亡作用時(shí)，必須共同激活STAT5、PI3K/AKT 及其它通路才能發(fā)揮作用，這表明比起造血細(xì)胞，對(duì)于神經(jīng)元來(lái)說(shuō)，EPO 的這些功能更顯得重要。

同時(shí)表明，EPO 的抗凋亡機(jī)制是多通路多途徑的且這些通路之間可能存在交叉對(duì)話(huà)。

最近，Gen 等［22］證實(shí)，外源性的EPO 可以誘使Nrf2 向核內(nèi)轉(zhuǎn)移同時(shí)上調(diào)HO-1 的表達(dá)，而在加入MAPKs 和PI3K 的抑制劑后，這種作用被消弱了，提示可能是通過(guò)激活PI3K、MAPK和Nrf2 通路從而誘使HO-1 表達(dá)來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的。Zhang 等［23］體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元建立缺氧缺糖模型，3 h 后進(jìn)行再灌注，發(fā)現(xiàn)HIF-1α 及VEGF 在4 h 時(shí)開(kāi)始升高，并在8 h 時(shí)達(dá)到高峰。同時(shí)p-AKT 也升高并在4 h 時(shí)達(dá)到高峰，早于HIF-1α 的表達(dá)。再用PI3K/AKT 通路的抑制劑青霉素做預(yù)處理后會(huì)發(fā)現(xiàn)，p-AKT 及HIF-1α 的表達(dá)都下降了，提示HIF-1α 可能參與PI3K/AKT 這一通路。在Aβ 所致的帕金森模型中［24］，加入PI3K 抑制劑LY294002 后，EPO 的抗凋亡作用被抑制了，同時(shí)EPO 也誘導(dǎo)PI3K/AKT 的下游基因GSK-3β 磷酸化，提示GSK-3β 也參與EPO 的細(xì)胞保護(hù)作用，而且在這里抗凋亡蛋白Bcl-2 也是升高的。Pregi等［25］在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中加入25 ng/ml 的TNF-α 所致的凋亡模型中發(fā)現(xiàn)，EPO 的介入可以使抗凋亡蛋白例如Bcl-2 及NF-ΚB 的表達(dá)上調(diào)。Kim 等［26］在結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈所致的缺血缺氧模型中，EPO 的介入可以上調(diào)Bcl-2 的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)促凋亡基因Bax 及caspase-3 的表達(dá)，發(fā)揮抗凋亡作用，而且Bax/Bcl-2 的比例也是下降的。但是，Maier 等［27］發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性硬化的模型中，EPO 所致的Bcl-2 的上調(diào)及Bax的下調(diào)并不是通過(guò)激活PI3K 引起的，而且抑制MAPK 磷酸化后Bax 及Bcl-2 的水平不受影響。Shen 等［28］發(fā)現(xiàn)，EPO 增強(qiáng)BAD 磷酸化及Bcl-x的表達(dá)與對(duì)促凋亡基因Bax 的下調(diào)是通過(guò)ERK 及AKT 通路實(shí)現(xiàn)的。這些提示EPO 發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制是復(fù)雜多樣的，還需進(jìn)一步的研究。

圖1 EPO/EPO-R 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路示意圖［18］Fig.1 Signal transduction pathway of EPO/EPO-R

4 EPO 的神經(jīng)保護(hù)作用臨床研究及其安全性

EPO 作為一種安全的藥物應(yīng)用于臨床已經(jīng)20 多年了，重組EPO 及各種替代品主要應(yīng)用于腎臟疾病、多種原因(如惡性腫瘤放療和嚴(yán)重感染)引起的惡性貧血及各種腫瘤疾病的輔助性治療。但是隨著EPO 被證實(shí)具有神經(jīng)保護(hù)作用后，最近十幾年，有一系列的臨床試驗(yàn)研究了EPO 是否真的具有神經(jīng)保護(hù)及再生的功能，從腦缺血、神經(jīng)損傷到炎癥及神經(jīng)退行性變，比較欣慰的是，這些研究大多證實(shí)了EPO的治療是有效的［29-30］。

最早的一個(gè)臨床試驗(yàn)是Ehrenreich 等［31］研究的，該試驗(yàn)采用雙盲對(duì)照的方法，試驗(yàn)組患者每天一次靜脈注射3.3×104IU 的EPO，30 d后發(fā)現(xiàn)腦脊液中的EPO 的量是對(duì)照組的60～100 倍，提示靜脈注射rhEPO 是可以到達(dá)腦部的，影像學(xué)的方法檢查發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組的腦梗死面積縮小，且在1月后臨床表現(xiàn)有明顯的改善，這些提示靜脈注射大劑量的rhEPO 對(duì)中風(fēng)患者治療是有效的。同時(shí)，Ehrenreich 等［32］通過(guò)另一項(xiàng)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于慢性進(jìn)展性的多發(fā)性硬化患者，大劑量的EPO 可改善患者的運(yùn)動(dòng)與認(rèn)知功能，而通過(guò)對(duì)比，小劑量的EPO 并不能起到上述作用。Tseng 等［33］在對(duì)EPO 是否對(duì)動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(aSAH)患者有保護(hù)作用的研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)aSAH 患者靜脈注射30 000IU 的EPO 可以降低aSAH 所引起的遲發(fā)性腦缺血，并且認(rèn)為這種作用可能是由于EPO 可以減輕腦血管痙攣的嚴(yán)重程度及縮短受損的自我調(diào)節(jié)過(guò)程所致。Abrishamkar 等［34］在一項(xiàng)雙盲隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，靜脈注射EPO 對(duì)彌漫性軸索損傷的患者進(jìn)行干預(yù)，隔天注射2000U EPO，共2 周，采用格拉斯哥昏迷評(píng)分及格拉斯哥預(yù)后評(píng)分進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組患者病情恢復(fù)較對(duì)照組更早，且試驗(yàn)組患者的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及紅細(xì)胞比容，與對(duì)照組相比，并沒(méi)有明顯升高，對(duì)于彌漫性軸索損傷的患者來(lái)說(shuō)，靜脈注射此劑量的EPO 是比較安全的。所以說(shuō)，EPO 對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療是有效地，但還需進(jìn)一步證實(shí)。

雖然EPO 已經(jīng)應(yīng)用于臨床多年，但是有研究表明使用EPO 的癌癥或慢性腎病的病人有發(fā)生血栓栓塞并發(fā)癥的危險(xiǎn)，而且Ehrenreich等［35］在一次臨床研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)急性腦缺血患者癥狀出現(xiàn)后的6 h、24 h、48 h 分別靜脈注射40 000 IU 的EPO，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組存在安全問(wèn)題，特別是對(duì)于全身溶栓的患者。最近幾年，大量臨床試驗(yàn)研究了EPO 對(duì)于新生兒神經(jīng)保護(hù)作用與安全性問(wèn)題。WU 等［36］發(fā)現(xiàn)給予新生兒缺血缺氧的患兒不同劑量的EPO，分別為250、500、1000、2500 U/kg，每48 h 一次，共6次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有出現(xiàn)不良反應(yīng)或死亡的情況。但是，EPO 作為神經(jīng)保護(hù)作用藥物，在臨床上應(yīng)用于成人時(shí)其安全性問(wèn)題的相關(guān)文獻(xiàn)較少，對(duì)于成人來(lái)說(shuō)，應(yīng)用EPO 治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，其劑量及安全問(wèn)題還需進(jìn)一步摸索。

綜上所述，EPO 作為一種神經(jīng)保護(hù)劑是毋庸置疑的，作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的用藥有很大的應(yīng)用前景，但是仍需要大量的臨床研究去證實(shí)。

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