潘永苗，徐向榮，錢羽力，周彩云，徐 鍵

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

近年來(lái)，新的化療和放療方案應(yīng)用，使得患有惡性腫瘤的年輕婦女生存率有了較大的提高，但化療和放療極易造成卵巢組織不同程度甚至永久性損傷，引起患者月經(jīng)失調(diào)、閉經(jīng)、卵巢早衰，甚至喪失生殖和內(nèi)分泌能力。如何保存此類年輕婦女的卵巢功能成為迫切需要解決的問(wèn)題。卵巢組織冷凍保存是一種較有前途的卵巢功能保存方法［1-2］。但冷凍可能對(duì)卵巢組織尤其是卵細(xì)胞造成不同程度的冷凍損傷［3-4］，從而影響卵巢組織的凍存效率。本研究采用麥管玻璃化冷凍人類卵巢組織，與新鮮卵巢組織比較，探討玻璃化冷凍對(duì)人類卵巢組織中卵泡組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞增殖活性的影響，為探索卵巢組織凍融方法和進(jìn)一步在體外培養(yǎng)、移植等研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 卵巢組織取自12 例來(lái)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院行腹腔鏡下或進(jìn)腹手術(shù)行卵巢良性囊腫切除的患者;術(shù)中取囊腫被覆上皮或修剪整形卵巢組織多余上皮。病理診斷:10 例為卵巢畸胎瘤，2 例單純性囊腫。年齡25～37歲，月經(jīng)規(guī)律，無(wú)痛經(jīng)史，無(wú)內(nèi)分泌疾病和服激素藥物史，無(wú)化療放療史。卵巢組織冷凍保存經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集的人卵巢組織放入室溫保存的磷酸鹽緩沖液中迅速轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。清洗組織，剔除卵巢髓質(zhì)保留皮質(zhì)部分，將卵巢組織在室溫磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌5次，用眼科剪剪成約1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，每例標(biāo)本預(yù)留2 塊作為新鮮組(A組)，經(jīng)40 g/L 中性甲醛固定后行常規(guī)石蠟包埋切片;余組織塊作為玻璃化冷凍組(B組)。

1.2.2 組織玻璃化冷凍 將處理后的組織塊浸泡在快速冷凍液中(含有5.5 mol/L 乙二醇、1.0 mol/L 蔗糖、10%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液)，在室溫下平衡10 min，用麥管(0.25 ml)按3 段式法裝管，封口泥封口后直接投入液氮中保存1 周。

1.2.3 解凍復(fù)蘇 玻璃化凍存的卵巢組織塊采用3 步法依次在含有1.0 mol/L 蔗糖和10%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液，0.5 mol/L 蔗糖和5%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液，以及0.25 mol/L蔗糖和2.5%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液中逐步稀釋去除冷凍保護(hù)劑，每次平衡10 min，最后在磷酸鹽緩沖液中沖洗2次(每次5 min)。將解凍的卵巢組織分別放入25 g/L 戊二醛和福爾馬林(40 g/L)中固定。

1.3 組織學(xué)檢查 將新鮮固定組織和凍融復(fù)蘇后固定組織塊常規(guī)脫水、透明，每塊組織單獨(dú)石蠟包埋，以4μm 厚度連續(xù)切片，HE 染色后光鏡下讀片統(tǒng)計(jì)。依據(jù)Gougeon［5］標(biāo)準(zhǔn)觀察卵泡形態(tài):卵泡和卵母細(xì)胞均呈圓形，卵母細(xì)胞核無(wú)固縮，顆粒細(xì)胞分布均勻，基底膜完整的為正常卵泡結(jié)構(gòu);卵泡結(jié)構(gòu)不完整或消失，卵母細(xì)胞核固縮或皺縮，顆粒細(xì)胞排列紊亂的為異常卵泡。統(tǒng)計(jì)每片中形態(tài)正常和異常的原始和初級(jí)卵泡比例。

1.4 免疫組化測(cè)定卵巢組織中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá) 采用組織學(xué)檢查的切片(PCNA 試劑盒購(gòu)自北京中衫金橋公司)，Envision 二步法操作測(cè)定。結(jié)果判定以光鏡下組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核內(nèi)見(jiàn)棕黃色顆粒沉著，染色明顯高于背景為陽(yáng)性細(xì)胞;卵母細(xì)胞或顆粒細(xì)胞PCNA 陽(yáng)性表達(dá)為PCNA 陽(yáng)性卵泡。同時(shí)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性卵泡比例數(shù)(PCNA 陽(yáng)性卵泡/卵泡總數(shù))。

1.5 電鏡檢查 在A組新鮮組織塊和B組凍融組織塊中各選2 塊卵巢組織，經(jīng)25 g/L 的戊二醛固定、包埋修塊后半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡下定位組織學(xué)形態(tài)正常的原始卵泡，超薄切片后經(jīng)醋酸鈾及硝酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察卵泡超微結(jié)構(gòu)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 比較新鮮組織和凍融組織中原始卵泡和初級(jí)卵泡分布和形態(tài)正常比例，以及PCNA 陽(yáng)性卵泡比例采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組卵巢組織光鏡觀察結(jié)果

2.1.1 新鮮和凍融卵巢組織卵泡計(jì)數(shù) 兩組卵巢組織中主要為原始卵泡，初級(jí)卵泡明顯少于原始卵泡。A組中卵泡185個(gè)，其中原始卵泡146個(gè)(86.4%)，初級(jí)卵泡39個(gè)(13.6%);B組中卵泡162個(gè)，其中原始卵泡137個(gè)(84.5%)，初級(jí)卵泡25個(gè)(15.5%)。A、B 兩組原始和初級(jí)卵泡分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.37，P ＞0.05)。

2.1.2 新鮮和凍融卵巢組織形態(tài) A、B 兩組卵巢組織中原始卵泡大多數(shù)形態(tài)正常，分別占75.3%和69.3%，形態(tài)正常的卵泡保持圓形或橢圓形，卵母細(xì)胞核完整，顆粒細(xì)胞排列均勻，未見(jiàn)核固縮(圖1)。但觀察到部分卵泡形態(tài)異形，卵母細(xì)胞核面積縮小或固縮，胞漿比例增大，顆粒細(xì)胞排列疏松或紊亂，基底膜欠完整，部分卵泡閉鎖(圖2)。與A組比較，玻璃化凍融后原始卵泡光鏡下形態(tài)異常率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。但是，其初級(jí)卵泡凍融后形態(tài)異常的比例(56%)高于新鮮組織(28.2%，P＜0.05)。

表1 新鮮組和凍融組中卵泡形態(tài)正常和異常的比例變化Table 1 The proportion of follicles with normal and abnormal morphology in fresh and frozen-thawed tissue ［n，(%)］

2.2 新鮮和凍融卵巢組織PCNA 表達(dá) 新鮮和凍融后卵巢組織均可見(jiàn)PCNA 陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)主要位于原始卵泡、初級(jí)卵泡以及間質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)(圖3A、圖3B)。新鮮組織PCNA 陽(yáng)性卵泡比例為15.5%，凍融組織中陽(yáng)性卵泡比例為13.5%，兩組比較差異無(wú)顯著性(P ＞0.05)。

圖3 PCNA 陽(yáng)性表達(dá)于新鮮卵巢組織(A) 和凍融卵巢組織(B) 卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞(×400)Fig.3 Positive expression of PCNA in oocyte and granulsa and stromal cells in fresh tissue(A) and frozen-thawed tissue(B) (envision system staining×400)

2.3 兩組卵巢組織電鏡觀察結(jié)果 A、B 兩組中均可見(jiàn)超微結(jié)構(gòu)正常的原始卵泡，卵母細(xì)胞居中、圓形，核膜及核仁清晰完整，卵母細(xì)胞膜、核膜與線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜完整，顆粒細(xì)胞膜完整，排列整齊，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞核完整，染色質(zhì)分布均勻(圖4A)。但在凍融組初級(jí)卵泡中可見(jiàn)卵母細(xì)胞和前顆粒細(xì)胞胞漿內(nèi)基質(zhì)電子密度略有下降，部分線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹并出現(xiàn)小空泡(圖4B、圖4C);個(gè)別卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞胞漿中存在無(wú)細(xì)胞器區(qū)和空泡增多，嚴(yán)重者核膜局部凹陷甚至破裂(圖4C)。

圖4 新鮮和凍融卵巢組織的超微結(jié)構(gòu)Fig.4 Ultrastructure of fresh and frozen-thawed ovarian tissue ultrastructure

3 討論

慢凍速融和玻璃化冷凍是卵巢組織冷凍保存的主要方法，玻璃化冷凍技術(shù)由于保存和保持組織細(xì)胞溶液內(nèi)水分子和離子的分布，極大地避免了細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，因此冷凍保存后對(duì)人卵巢組織內(nèi)原始卵泡和顆粒細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)影響相對(duì)較小［6-7］，但目前經(jīng)典的慢凍速融比較玻璃化冷凍技術(shù)對(duì)卵泡質(zhì)量和復(fù)蘇后卵巢組織生物活性的影響尚有爭(zhēng)議［4，8-9］。玻璃化冷凍技術(shù)有較多種改良方法，其中組織物直接與液氮接觸能提高冷凍速率，但存在被微生物或病毒污染的可能［10］，本實(shí)驗(yàn)采用較為安全的、不與液氮直接接觸的麥管裝載法玻璃化冷凍人卵巢組織，復(fù)蘇后光學(xué)顯微鏡下檢查原始卵泡分布比例為84.5%，與文獻(xiàn)報(bào)到的70%～90%基本一致，原始卵泡卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞異常率(30.7%)與新鮮組織(24.7%)比較也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)，而初級(jí)卵泡形態(tài)學(xué)異常率高于新鮮組織。這提示玻璃化冷凍對(duì)體積相對(duì)較大的初級(jí)卵泡細(xì)胞容易造成損傷，對(duì)體積較小的原始卵泡有較好的冷凍保持效率，光鏡下觀察組織學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，小鼠卵巢組織玻璃化冷凍后原始卵泡的超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變［6］，而在人類卵巢組織研究中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論慢凍速融和玻璃化冷凍卵巢組織原始卵泡均有一定程度的超微結(jié)構(gòu)改變，這些細(xì)微的結(jié)構(gòu)改變是否對(duì)進(jìn)一步的組織移植后生物活性產(chǎn)生影響，則較難精確預(yù)測(cè)［8，11］，原始卵泡發(fā)育潛能需經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)和移植物檢測(cè)得以驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)對(duì)光鏡檢查無(wú)明顯改變的組織細(xì)胞進(jìn)一步作了透射電鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)部分卵泡超微結(jié)構(gòu)有一定改變，主要表現(xiàn)為部分細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹并出現(xiàn)少量小空泡，卵母細(xì)胞和前顆粒細(xì)胞胞漿內(nèi)基質(zhì)電子密度有下降，個(gè)別卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞胞漿中存在無(wú)細(xì)胞器區(qū)和空泡增多，核膜凹陷，也可見(jiàn)部分顆粒細(xì)胞膜的不完整，這種改變?cè)诔跫?jí)卵泡多見(jiàn)，這可能與初級(jí)卵泡代謝較原始卵泡旺盛，更容易發(fā)生冷凍損傷或組織離體后短時(shí)的缺血缺氧等有關(guān)［8，13］。在原始卵泡這種超微結(jié)構(gòu)的改變較少見(jiàn)，而且不明顯。Stefania等［13］研究發(fā)現(xiàn)，原始卵泡即使發(fā)生這種細(xì)微和暫時(shí)的冷凍損傷可能為復(fù)蘇后組織移植存活后細(xì)胞本身所修復(fù)，并能進(jìn)一步發(fā)育成初級(jí)卵泡。PCNA 表達(dá)是卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)的最早期指標(biāo)［14］，本研究結(jié)果顯示，新鮮和凍融卵巢組織中PCNA 均有表達(dá)，主要集中在卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，兩者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此推測(cè)，玻璃化冷凍能有效地保存卵巢組織中的卵泡，尤其是原始卵泡，對(duì)其組織學(xué)形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)及啟動(dòng)進(jìn)一步發(fā)育潛能影響甚小。但玻璃化冷凍復(fù)蘇異體移植后可觀察到卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞早期發(fā)育的非同步化［13］，這是否對(duì)卵泡進(jìn)一步發(fā)育造成影響有待研究。

卵巢組織的冷凍保存成為繼胚胎和卵細(xì)胞冷凍之外保存女性生殖和內(nèi)分泌能力的又一極具潛力手段。卵巢組織內(nèi)存在大量體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、代謝率低、對(duì)溫度低敏感的未成熟卵母細(xì)胞，其為有效凍存提供了基礎(chǔ)。隨著研究深入，玻璃化冷凍不失為一種簡(jiǎn)單而有效的凍存卵巢組織的基礎(chǔ)技術(shù)之一。

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