謝章明，劉文慧，徐迎春，陳樞青

(浙江大學(xué)藥學(xué)院藥理毒理與生化藥學(xué)研究所，浙江 杭州 310058)

細胞色素P450(cytochrome P450，CYP)是一大類含有鐵卟啉輔因子的蛋白超家族。在眾多的P450 中，CYP3A4 是人肝臟中最豐富的一類酶，也是與臨床用藥代謝最相關(guān)的一類酶［1］。由于CYP3A4 酶活性中心有個較大的“口袋”，從而使其具有了較寬的底物結(jié)合選擇性［2］。也正因為如此，CYP3A4 代謝了超過50%的臨床用藥［3］，如免疫抑制劑環(huán)孢素、解熱鎮(zhèn)痛藥乙酰氨基酚、鎮(zhèn)靜催眠藥地西泮以及鎮(zhèn)痛藥可待因等。

由于從人組織中得到的CYP3A4 不容易保持其原有的催化活性，而且來源不多，因此人們通過基因重組的方法進行CYP3A4 的異源表達。在實際研究過程中，人們嘗試并比較了多種表達系統(tǒng)，其中桿狀昆蟲表達系統(tǒng)［4］不僅表達量高，而且具有正確的糖基化、磷酸化和組織定位表達等優(yōu)點，其表達的蛋白生物學(xué)特性與天然蛋白相似，可以建立高預(yù)測能力的代謝模型，對臨床用藥有很大的指導(dǎo)意義。為此，本研究用Sf 9 細胞共表達了CYP3A4、POR 及cyt b5，并對其表達條件進行了優(yōu)化，以期得到表達量高、代謝活性強的微粒體，從而用于體外藥物和毒物的代謝研究，以及臨床藥物相互作用的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養(yǎng)及主要試劑 草地夜蛾卵巢(Spodoptera frugiperda，Sf 9)細胞(由海南養(yǎng)生堂公司饋贈)，胎牛血清(Gibco，Invitrogen 公司)，Grace's昆蟲細胞培養(yǎng)基(Gibco，Invitrogen公司)，Cellfectin(Invitrogen 公司)。

1.1.2 菌株及質(zhì)粒 大腸桿菌菌株E.coli DH5α(由本實驗室保存)，DH10Bac 菌株(Invitrogen 公司)，載體pFastBac 1(Invitrogen公司)，pGEM-CYP3A4、pGEM-POR 及pGEM-cyt b5(由本實驗室先前構(gòu)建)。

1.1.3 生物及化學(xué)試劑 KOD-plus DNA polymerase(Toyobo 公司)，T4 DNA 連接酶、BamH I、Xho I、Not I、Sph I(TaKaRa 公司)，AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit(Axygen Biosciences 公司)，PCR 引物合成和DNA 測序服務(wù)均由上海生物工程有限公司提供，X-gal、蛋白胨和酵母提取物(BBI 公司)，瓊脂糖、瓊脂粉、IPTG、氨芐青霉素、慶大霉素、四環(huán)霉素和硫酸卡那霉素(上海生物工程有限公司)，K3PO4(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，無水乙醇(杭州大方化學(xué)試劑廠)。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 Centrifuge 5415 冷凍離心機 (Eppendorf 公司)，Allegra 64R Centrifuge 冷凍離心機(Beckman 公司)，Master Gradient PCR 擴增儀(Eppendorf 公司)，VS-840-2 型超凈工作臺(上海博迅科學(xué)儀器廠)，LRH-250-Ⅱ微電腦控制生化培養(yǎng)箱(廣東醫(yī)療器械廠)，Universal hood 凝膠成像系統(tǒng)(美國BIORAD 公司)，GeneQμant 核酸蛋白測定儀(安瑪西亞公司)，Agilent 1200 高效液相色譜儀(Agilent 公司)。

1.2 方法

1.2.1 Bacmid-CYP3A4、Bacmid-POR 和Bacmid-cyt b5重組黏粒的制備 分別將CYP3A4、POR和cyt b5這3 種基因的PCR 產(chǎn)物與pFastBac 1載體質(zhì)粒一起進行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物用T4連接酶在16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細胞中，挑取單克隆進行雙酶切及測序鑒定。將鑒定正確的3 種重組載體轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細胞中，進行藍白斑篩選，挑取白斑提黏粒進行PCR 和測序鑒定。

1.2.2 轉(zhuǎn)染及3 種昆蟲病毒的擴增 將測序正確的Bacmid-CYP3A4、Bacmid-POR 和Bacmid-cyt b5重組黏粒分別轉(zhuǎn)染Sf 9 細胞，72 h 后收集細胞培養(yǎng)液，500×g 離心5 min，吸取上清即為第一代病毒液P1;用P1 感染Sf 9 細胞，72 h后按上述方法離心收集可得到P2，進一步擴增又可得到P3，一般P3 便可用于蛋白的表達。

1.2.3 Real-Time PCR 法測病毒滴度［5］從DH10Bac 菌中提取空白Bacmid-pFastBac DNA，用GeneQuant 儀器測定其質(zhì)量濃度為1608μg/ml，然后用雙蒸水對其進行逐級稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為160.8、16.08、1.608、1.608×10-1μg/ml 和1.608×10-2μg/ml，將其作為隨行標準曲線。然后用病毒基因組提取試劑盒從上述3 種P3 病毒液中提取病毒基因組，并分別稀釋10 倍和100 倍作為樣品。Real-time PCR 上下游引物分別為，上游:5'-ATGATCAACATGGGAGAC TCCCACGTGG-3'，下 游:5'-CTAGCTCCACACGT CCAGGGAGTAGC-3';PCR 反應(yīng)體系10μl，其中模板0.8μl，反應(yīng)參數(shù):95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸8 s，40次循環(huán)。

1.2.4 Sf 9 細胞的懸浮培養(yǎng)［6］及其條件優(yōu)化由于制備微粒體需要大量的細胞，而Sf 9 細胞本身是半貼壁生長的，因此本實驗采用懸浮培養(yǎng)的方法對Sf 9 細胞進行大批量培養(yǎng)。實驗中首先對細胞懸浮培養(yǎng)的條件進行了摸索，通過每天對細胞的計數(shù)繪制細胞的生長曲線;然后，在細胞懸浮培養(yǎng)時主要對以下5個條件進行優(yōu)化:恒溫搖床的溫度、恒溫搖床的轉(zhuǎn)速、每個搖瓶中細胞液的量、表面活性劑的加量及細胞應(yīng)培養(yǎng)的時間。

1.2.5 CYP3A4 與POR 和cyt b5的共表達將上述制備的3 種P3 病毒液按v-CYP3A4、v-POR和v-cyt b5的體積比，分別為1∶0.5∶1、1∶1∶1、1∶1.5∶1和1∶2∶1的比例加入至Sf 9 細胞中，24 h 后加入無菌的氯高鐵血紅素溶液至終質(zhì)量濃度為3μg/ml，表達72 h 后500×g 離心5 min，收集細胞，1×PBS 洗滌細胞數(shù)次，最后1 000×g 離心5 min，棄盡上清。

1.2.6 微粒體的制備 收集的表達細胞加入適量含PMSF 的P450 溶解液，冰浴超聲破碎，功率30 W，超聲15次，每次6 s，間隔14 s。然后，4℃，9 000×g 離心20 min，取上清即為S9溶液。將S9 置于高速離心機中，4℃，19 000×g 離心15 min，取上清置于超高速離心機中，4℃，100 000×g 離心55 min，棄去上清，沉淀用100 mmol/L pH 7.4 的磷酸鉀緩沖液溶解即得到微粒體溶液。

1.2.7 代謝條件選擇 將微粒體用新鮮配制的再生系統(tǒng)分別稀釋至0.5、1.0、1.5、2.0 mg/ml 進行孵育，最后將代謝產(chǎn)物峰對酶濃度作圖，用來考查代謝的最佳酶濃度。將代謝孵育時間分別設(shè)為0、10、20、40、60 和90 min，最終將代謝產(chǎn)物峰對孵育時間作圖，用來考查最佳的代謝孵育時間。

1.2.8 代謝動力學(xué)參數(shù)比較 將4 種不同的微粒體用新鮮配制的再生系統(tǒng)稀釋至上述最佳酶濃度，加入底物睪酮使其終濃度為0、10、20、50、100、150、200、300μmol/L，混勻，在37℃水浴中預(yù)孵育5 min，立即加入NADP/NADPH 啟動反應(yīng)。孵育時間為上述得到的最佳孵育時間，然后加200μl 冰乙腈渦旋，沉淀蛋白并終止反應(yīng)，置于預(yù)先冷卻的離心機中4℃，16 000×g 離心20 min，取上清HPLC 分析，測定代謝產(chǎn)物6β-羥基睪酮濃度，每個樣品平行3 份操作。最后，通過GraphPad Prism 5(Vision 5.01)計算米氏常數(shù)Km值、最大反應(yīng)速率Vmax值以及內(nèi)在代謝清除率CLint(Vmax/Km)。

2 結(jié)果

2.1 Bacmid-CYP3A4、Bacmid-POR 和Bacmid-cyt b5重組黏粒的PCR 鑒定 以M13(+)/M13(-)作為上下游引物分別對重組黏粒Bacmid-CYP3A4、Bacmid-POR 和Bacmid-cyt b5進行PCR，其產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖1)。結(jié)果顯示，3 種重組黏粒Bacmid-CYP3A4、Bacmid-POR 和Bacmid-cyt b5的PCR 產(chǎn)物分別在約3 800 bp、4 400 bp 和2 700 bp 處得到一條明亮條帶，與理論值相符。

圖1 Bacmid-CYP3A4、Bacmid-POR 和Bacmid-cyt b5重組黏粒的PCR 鑒定電泳圖Fig.1 The PCR products of the recombinant Bacmid-CYP3A4，Bacmid-POR and Bacmid-cyt b5

2.2 三種P3 病毒的滴度 Real-Time PCR 法測病毒滴度(圖2 和表1)，所得到的3 種P3 病毒v-CYP3A4、v-POR 和v-cyt b5的滴度分別為128.9μg/ml、31.7μg/ml 和11.5μg/ml。圖2示DNA 模板從128.6 ng 逐級稀釋至0.01286 ng 得到，病毒滴度測定標準曲線在0.01286 ng～128.6 ng 之間時線性良好。

圖2 病毒滴度測定標準曲線(n=3)Fig.2 Standard calibration curve of viral titer quantitation(n=3)

表1 v-CYP3A4、v-POR 和v-cyt b5三種P3 病毒的滴度測定結(jié)果Table 1 Real-time PCR titration results for v-CYP3A4，v-POR and v-cyt b5(n=3)

2.3 Sf 9 細胞的懸浮培養(yǎng)條件 對Sf 9 細胞懸浮培養(yǎng)中各條件進行了優(yōu)化，從而得到了一組最合適的懸浮培養(yǎng)條件(圖3)。最佳的細胞培養(yǎng)條件是:恒溫搖床的溫度為27℃，轉(zhuǎn)速為90 r/min，每250 ml 搖瓶中加80～120 ml 初始密度為5×105個/ml 細胞液，并加入0.1%的Pluronic?F-68，細胞培養(yǎng)72 h。用此條件進行懸浮培養(yǎng)時，最適合細胞的生長和目的蛋白的表達。

圖3 懸浮培養(yǎng)時Sf 9 細胞的生長曲線Fig.3 Cell growth curve of Sf 9 in shake-flask culture

2.4 微粒體的代謝條件 用微粒體代謝底物睪酮時，在0 到90 min 內(nèi)(圖4A)，代謝物生成量呈線性增長，說明在此時間段內(nèi)，睪酮的代謝速率具有良好的線性。當微粒體蛋白濃度在0.5 mg/ml 至2.0 mg/ml 范圍內(nèi)(圖4B)，代謝物的生成量也是呈線性增長的，說明在此蛋白濃度范圍內(nèi)，微粒體代謝睪酮的速率也具有良好的線性，且在2.0 mg/ml 濃度以下時，酶沒有飽和?？紤]到實驗需要一定的代謝量以利于定量，因此本實驗選擇了代謝孵育時間為1 h，蛋白濃度為1 mg/ml。

圖4 微粒體代謝的產(chǎn)物量與時間(A) 及與微粒體蛋白濃度(B) 的關(guān)系Fig.4 The relationship between metabolic amount and incubation time(A) and between metabolic amount and microsome protein concentration(B)

圖5 不同微粒體代謝睪酮的代謝動力學(xué)曲線及其Lineweaver-Burk 圖Fig.5 The kinetic curves and Lineweaver-Burk plot of the metabolism of testosterone by different microsomes

2.5 不同微粒體的代謝動力學(xué)參數(shù)及代謝活性比較 分別比較4 種微粒體的代謝動力學(xué)參數(shù)時(圖5A 和B，表2)，發(fā)現(xiàn)當CYP3A4∶POR∶cyt b5=1∶1∶1的比例時，Km值為119.6μmol/L，Vmax為0.52μmol/(min·g 蛋白)，此時CLint為4.34 ml/(min·g 蛋白)，為4 種微粒體中最大，說明當CYP3A4∶POR∶cyt b5=1∶1∶1時，所表達的微粒體代謝活性最高。

表2 不同微粒體代謝睪酮得到的代謝動力學(xué)參數(shù)Table 2 Parameters for kinetics of metabolism of testosterone by different microsomes(n=3)

3 討論

人CYP3A4 是人肝臟中主要的一類細胞色素P450 酶，它負責代謝大量的臨床用藥及部分環(huán)境污染物和內(nèi)源性物質(zhì)［7］。細胞色素P450氧化還原酶(cytochrome P450 oxidoreductase，POR)是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上專一為細胞色素P450傳遞電子的一類蛋白。細胞色素b5(cytochrome b5，cyt b5)則 接 受NADH:cyt b5還 原 酶 或NADPH:POR 系統(tǒng)傳遞的電子，并最終將電子傳遞給CYP 或其他酶［8］。單獨表達的CYP3A4由于缺少POR 及cyt b5等電子轉(zhuǎn)運蛋白而沒有活性。因此，本研究通過共表達CYP3A4、POR及cyt b5的方法，以及表達條件的優(yōu)化來獲得較高代謝活性的微粒體。

本研究以桿狀昆蟲表達系統(tǒng)，對CYP3A4、POR 及cyt b5進行了共表達，并對搖床的溫度、轉(zhuǎn)速、搖瓶中細胞液的量、表面活性劑的加量、細胞的培養(yǎng)時間及3 種病毒的加量比例等表達條件進行了優(yōu)化。最終通過細胞的生長曲線和表達產(chǎn)物制得微粒體對睪酮的代謝動力學(xué)曲線。本研究發(fā)現(xiàn)，當恒溫搖床的溫度為27℃，轉(zhuǎn)速為90 r/min，每250 ml 搖瓶中加入80～120 ml 細胞密度為5×105個/ml 的細胞液，并加入0.1%的Pluronic? F-68，細胞培養(yǎng)72 h時，最適合細胞的生長和目的蛋白的表達。此時，當3 種病毒的加量比例為1∶1∶1時，表達條件最佳，其對底物睪酮代謝的Km值、Vmax和CLint分別為119.6μmol/L、0.52μmol/(min·g蛋白)和4.34 ml/(min·g 蛋白)。接下去我們將通過更換表達載體和蛋白融合的表達方法來進一步提高目的蛋白的表達量及CYP3A4 的代謝活性。

在新藥開發(fā)的早期，藥物代謝的研究可以促進新化合物的篩選效率，并提高其在臨床上的成功率［9］。而在新藥的篩選和開發(fā)過程中，研究者通常運用兩種不同的體外代謝研究方法來評價基于CYP 的藥物-藥物相互作用(drugdrug interaction，DDI)［10］。一種方法是研究該新藥的代謝途徑以及其它藥物對該新藥代謝的影響。另一種方法是研究該新藥對其它藥物代謝的影響。這兩種方法都需要研究不同的CYP 酶和不同的底物。在藥物-藥物相互作用的研究中，人們發(fā)現(xiàn)不同的底物和代謝環(huán)境會對結(jié)果造成很大的不同，而CYP3A4 在這個現(xiàn)象中尤其明顯［11］。

另外，由于CYP3A4 基因的多態(tài)性，不同人種以及同一人種的不同群體間都會攜帶不同的CYP3A4 突變體，如CYP3A4* 3、CYP3A4* 4、CYP3A4* 5 及CYP3A4* 18［12-13］等。CYP3A4的這些突變體必然會引起CYP3A4 在代謝臨床用藥或環(huán)境污染物上的改變［14］。有些突變體相對于野生型的CYP3A4 來說代謝活性變大了，這就會造成臨床用藥的藥效下降;而有些突變體相對于野生型的CYP3A4 來說代謝活性減弱或消失了，這又會造成臨床用藥的毒性增加。因此，用定點突變異源表達的方法克隆表達出各種不同的CYP3A4 突變體，并將其用于臨床藥物的代謝檢測，有助于了解不同CYP3A4 突變體對某種藥物的代謝能力，從而為個體化用藥提供寶貴的參考數(shù)據(jù)［15-16］。

綜上，本研究通過三重共表達CYP3A4、POR 及cyt b5，以及對表達條件的優(yōu)化不僅提高了目的蛋白的表達量，而且還得到了較高代謝活性的CYP3A4，從而為新藥代謝及藥物-藥物相互作用研究奠定了基礎(chǔ)。此外，本研究的表達方法在經(jīng)過優(yōu)化后可以放大培養(yǎng)，并且可以用于其他藥物代謝酶(如 CYP2D6、CYP2A13、CYP2B6 等等)的表達［17-19］，從而可以獲得大量高代謝活性的藥物代謝酶，為實驗室及臨床前新藥的體外藥物代謝動力學(xué)試驗提供了不可或缺的酶源。另外，對各種藥物代謝酶突變體的表達及代謝活性測定也為個體化用藥提供了非常寶貴的參考數(shù)據(jù)。

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