謝章明，陳樞青 綜述

(浙江大學(xué)藥學(xué)院 藥理毒理與生化藥學(xué)研究所，浙江 杭州 310058)

在新藥研發(fā)過程中，藥物的代謝過程及藥物與其他藥物的相互作用是新藥研發(fā)早期安全性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵。在新藥研發(fā)的早期就開展藥物代謝及藥物-藥物相互作用(drug-drug interaction，DDI)的研究，將有助于獲得安全、有效的治療藥物［1］。而異源表達(dá)系統(tǒng)可以高效、大量獲得較高活性的重組人藥物代謝酶，從而在體外對某一個(gè)單一的藥物代謝酶進(jìn)行研究［2］。在實(shí)際的研究過程中，人們嘗試比較了多種表達(dá)系統(tǒng)，其中桿狀昆蟲表達(dá)系統(tǒng)［3］不僅表達(dá)量高，具有正確的糖基化、磷酸化和組織定位表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，而且所表達(dá)的蛋白生物學(xué)特性與天然蛋白相似，可以將其建立高預(yù)測能力的代謝模型，對臨床用藥有很大指導(dǎo)意義。

1 人細(xì)胞色素P450 異源表達(dá)

細(xì)胞色素P450 是一大類含有鐵卟啉輔因子的蛋白超家族。CYP 酶對內(nèi)源性物質(zhì)(包括類固醇、脂肪酸和膽固醇等)和外源性物質(zhì)(包括藥物、致癌物、環(huán)境污染物、殺蟲劑和草藥成分等)的代謝是至關(guān)重要的［4］。然而，從人組織中純化的細(xì)胞色素P450 不容易保持其原有的催化活性，且這種CYP 來源并不多，因此異源重組表達(dá)體系被越來越多的應(yīng)用于CYP450的表達(dá)當(dāng)中。到目前為止，幾個(gè)常用的表達(dá)體系，如大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等均已被用于CYP450 的表達(dá)。

1.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 相對于真核表達(dá)系統(tǒng)來說，原核表達(dá)系統(tǒng)具有技術(shù)上較容易、操作簡單、表達(dá)水平高、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)［5］。但是，原核表達(dá)系統(tǒng)也有許多不可避免的缺點(diǎn)，如蛋白翻譯后的折疊和糖基化水平過于簡單，表達(dá)的膜蛋白與哺乳動(dòng)物蛋白結(jié)構(gòu)相差較多。對于CYP450 在大腸桿菌中的表達(dá)來說，需要對所表達(dá)酶的氨基酸末端區(qū)域進(jìn)行改造才能得到較高水平的表達(dá)［6］。另外，細(xì)菌中還缺乏CYP酶系催化反應(yīng)的一些輔酶，因此會(huì)造成所表達(dá)的CYP450 沒有活性。

1.2 酵母表達(dá)系統(tǒng) 酵母是第一個(gè)成功表達(dá)哺乳動(dòng)物CYP450 的表達(dá)系統(tǒng)［7］。相對于原核表達(dá)系統(tǒng)來說，酵母具有較完整的細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在其中所表達(dá)的蛋白不易水解，且不易形成包涵體。而相對于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來說，酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)水平高，生產(chǎn)周期較短，適合大批量的工作，且酵母本身的細(xì)胞色素P450 氧化還原酶被證明在酵母細(xì)胞的電子傳遞中是有效的［8］。但是，酵母細(xì)胞在沒有水解酶的情況下難以破裂，且表達(dá)載體不像細(xì)菌或哺乳動(dòng)物系統(tǒng)上的載體容易獲得。

1.3 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 用于表達(dá)人CYP 的哺乳動(dòng)物細(xì)胞種類廣泛，包括COS 細(xì)胞［9］、HepG2 細(xì)胞［10］、HK293 細(xì)胞［11］和CHO細(xì)胞［12］等。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)接近人體內(nèi)環(huán)境，且細(xì)胞本身含有輔助因子細(xì)胞色素P450 氧化還原酶和細(xì)胞色素b5等。但由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的CYP 本底含量高，使得重組蛋白的表達(dá)量相對較低，且哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)生長周期較長，成本也高，因此該系統(tǒng)表達(dá)CYP 主要用于致突變和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，而不常用于藥物代謝酶的大量表達(dá)及藥物的高通量篩選研究。

1.4 Bac-to-Bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是以昆蟲細(xì)胞(Sf 9 或Sf 21 等)作為表達(dá)宿主，直接以桿狀病毒穿梭載體Bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞進(jìn)行重組表達(dá)的一種表達(dá)系統(tǒng)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為一種高效的真核表達(dá)系統(tǒng)，不僅具有表達(dá)水平高的優(yōu)點(diǎn)，而且其翻譯后的蛋白能夠正確糖基化、磷酸化和組織定位表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物類似于天然產(chǎn)物［13］。但是，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)用于表達(dá)CYP 時(shí)，由于昆蟲細(xì)胞中缺少血紅素，因此需要在表達(dá)過程中人為加入血紅素，并且需要控制血紅素的加量。另外，由于桿狀病毒宿主細(xì)胞內(nèi)缺少CYP450 所需的電子轉(zhuǎn)運(yùn)體，所以用此方法表達(dá)的CYP 需要另外加入細(xì)胞色素P450 氧化還原酶或細(xì)胞色素b5才能發(fā)揮代謝活性［14］。

2 異源表達(dá)CYP 在新藥研發(fā)早期的作用

2.1 CYP 的表達(dá)與藥物代謝研究 在眾多的藥物代謝酶中，CYP 家族是藥物生物轉(zhuǎn)化過程限速步驟的主要酶系［15-16］。最初人們使用人組織制備的微粒體(如肝微粒體)進(jìn)行藥物代謝研究，由于人組織不易獲得，且不同人的組織之間差異較大，因此無法進(jìn)行藥物的高通量篩選和代謝研究。另外，人組織中所獲得的CYP酶是多種CYP 的混合物，難以進(jìn)行單一酶的代謝研究［17］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，克隆和異源表達(dá)人CYP 成為可能。異源表達(dá)能獲得單一的CYP，從而可以考查該酶對某種底物的代謝機(jī)制及動(dòng)力學(xué)參數(shù)。另外，由于異源表達(dá)的CYP 表達(dá)水平高，只需對條件進(jìn)行優(yōu)化便可以將其應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，從而使藥物的高通量篩選及體外代謝研究變得更加快捷、方便。

在新藥研發(fā)的早期，藥物代謝的研究不僅可以促進(jìn)新化合物的篩選效率，而且還能提高其在臨床上的成功率［15］。在新藥的篩選與研發(fā)過程中，研究者通常運(yùn)用兩種不同的體外代謝研究方法來評(píng)價(jià)基于CYP 的潛在藥物-藥物相互作用［18］。其中一種方法是描述該新藥的代謝途徑以及其它藥物對該新藥代謝的潛在影響。另一種方法則是評(píng)價(jià)該新藥對其它藥物代謝的影響。這兩種方法都需要研究不同的CYP 酶及底物。在藥物-藥物相互作用的研究中，人們發(fā)現(xiàn)底物和代謝環(huán)境的差異會(huì)對結(jié)果造成很大的不同，而CYP3A4 這種代謝酶在這個(gè)現(xiàn)象中尤為突出。Wang［19］等人研究了睪酮、特非那丁、咪達(dá)唑侖和硝苯地平這4 種常用CYP3A4 底物之間的相互抑制。他們發(fā)現(xiàn)，睪酮與特非那丁、睪酮與咪達(dá)唑侖以及特非那丁與咪達(dá)唑侖之間會(huì)部分相互抑制，硝苯地平也會(huì)抑制睪酮的6β-羥基化，但睪酮卻并不抑制硝苯地平的氧化。Emoto［20］等人利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)共表達(dá)了CYP3A4、POR 和cyt b5，并將其用于基于內(nèi)在清除率(intrinsic clearance)值的相對活性因子(relative activity factor)值的研究。他們認(rèn)為，該方法對于某藥物的代謝途徑及潛在副反應(yīng)研究具有很大貢獻(xiàn)，因此對新藥的篩選及早期開發(fā)也是非常有價(jià)值的。

2.2 CYP 突變體的表達(dá)與個(gè)體化用藥 由于CYP 基因的多態(tài)性，因此不同人種以及同一人種的不同群體間都會(huì)攜帶不同表型的CYP 突變體。CYP 的這些突變體必然會(huì)引起其在代謝臨床用藥或環(huán)境污染物上的差異［21］。有些突變體相對于原來野生型的CYP 來說代謝活性變大了，這就會(huì)造成臨床用藥的藥效下降;而有些突變體相對于原來野生型的CYP 來說代謝活性減弱或消失了，這又會(huì)造成臨床用藥的毒性增加［22-24］。對于某一種CYP(如CYP2D6)來說，可將不同表型的攜帶者分為超快代謝者、強(qiáng)代謝者、中間代謝者和慢代謝者［25］。

Liu［26］等人用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在Sf 9 細(xì)胞中分別表達(dá)了CYP2A13* 1/* 2/* 4/* 5/* 6/* 8/* 9，并以香豆素為底物，分別對CYP2A13 的野生型及各種突變體進(jìn)行代謝動(dòng)力學(xué)分析。最終他們發(fā)現(xiàn)，相對于野生型來說，突變體CYP2A13* 2/* 5/* 6/* 8/* 9 的代謝活性有一些改變，但改變幅度不大;而突變體CYP2A13* 4 對香豆素的代謝活性則完全喪失。

目前，藥物基因組學(xué)已被用來建立遺傳多態(tài)性和藥效差異之間的關(guān)系，這將會(huì)促進(jìn)個(gè)體化醫(yī)療的發(fā)展［27］。另外，研究遺傳因素對藥物代謝動(dòng)力學(xué)的影響，探明藥物代謝多態(tài)性、代謝的種族差異以及程度大小，可以指導(dǎo)優(yōu)化治療方案，實(shí)施個(gè)體化藥物治療，從而使療效最優(yōu)化，并使藥物副反應(yīng)降至最低［28-29］。因此，用定點(diǎn)突變異源表達(dá)的方法克隆表達(dá)出各種不同的CYP 突變體，并將其用于臨床藥物的代謝檢測，有助于了解不同CYP 突變體對某種藥物的代謝能力，從而為基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫的建立及個(gè)體化治療的方案提供寶貴的參考數(shù)據(jù)。

綜上所述，人體內(nèi)的藥物-藥物相互作用可能導(dǎo)致嚴(yán)重的副反應(yīng)，因此包括美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)在內(nèi)的許多機(jī)構(gòu)都對新藥開發(fā)時(shí)體內(nèi)和體外的藥物相互作用研究做了明文規(guī)定［30］。在體外藥物相互作用的研究中，基于CYP 代謝的藥物相互作用研究是主要研究對象［31-32］。人們不僅研究了各種CYP 酶的探針底物及抑制劑，還研究了各種CYP 突變體對藥物代謝及藥物相互作用的影響。由于人肝微粒體中的CYP 是多種CYP450 酶的混合，而FDA 規(guī)定新藥在臨床前必需要明確該藥物是由哪種酶代謝的［33］，因此人們開始通過各種表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)并純化單一的P450 酶，并將其用于體外的探針底物及抑制劑研究，從而為體內(nèi)的藥物相互作用提供可靠的參考［15］，并提供判斷新藥研究過程中是否繼續(xù)的依據(jù);同時(shí)，與基因多態(tài)性相關(guān)的酶活性數(shù)據(jù)可以幫助提供臨床個(gè)體化用藥時(shí)劑量的選擇依據(jù)。

［1］LIU Yao，CHEN Shuqing，ZENG Su，et al(劉 瑤，陳樞青，曾 蘇，等).The role of ADME evaluation in translation research of innovative drug［J］.Acta Pharmaceutica Sinica(藥學(xué)學(xué)報(bào))，2011，46(1):1-6.(in Chinese)

［2］ZHANG Xin，JONES D R，Hall S D.Prediction of the effect of Erythromycin，Diltiazem，and their metabolites，alone and in combination，on CYP3A4 inhibition ［J］.Drug Metabolism and Disposition，2009，37(1):150-160.

［3］HELVIG C，TAIMI M，CAMERON D.Function properties and substrate characterization of human CYP26A1，CYP26B1，and CYP26C1 expressed by recombinant baculovirus in insect cells ［J］.Journal of Pharmacological and Toxicological Methods，2011，64(3):258-263.

［4］SCOTT E E，HALPERT J R.Structures of cytochrome P450 3A4 ［J］.Trends in Biochemical Sciences，2005，30(1):5-7.

［5］BEHRENDORFF J B Y H，MOORE C D，KIM K H.Directed evolution reveals requisite sequence elements in the functional expression of P450 2F1 in Escherichia coli［J］.Chem Res Toxicol，2012，25(9):1964-1974.

［6］LIN H L，KENAAN C，HOLLENBERG P F.Identification of the residue in human CYP3A4 that is covalently modified by bergamottin and the reactive intermediate that contributes to the grapefruit juice effect［J］.Drug Metabolism and Disposition，2012，40(5):998-1006.

［7］GONZALEZ F J，KORZEKWA K R.Cytochromes P450 expression systems ［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，1995，35:369-390.

［8］PETERS F T，BUREIK M，MAURER H H.Biotechnological synthesis of drug metabolites using human cytochrome P450 isozymes heterologously expressed in fission yeast［J］.Bioanalysis，2010，2(7):1277-1290.

［9］CRANE A L，KLEIN K，OLSON J R.Bioactivation of chlorpyrifos by CYP2B6 variants ［J］.Xenobiotica，2012，7(10):1-8.

［10］GERETS H H J，TILMANT K，GERIN B.Characterization of primary human hepatocytes，HepG2 cells，and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins［J］.Cell Biol Toxicol，2012，28(2):69-87.

［11］OHNO S，KAWANA K，NAKAJIN S.Contribution of UDP-Glucuronosyltransferase 1A1 and 1A8 to morphine-6-glucuronidation and its kinetic properties ［J］.Drug Metabolism and Disposition，2008，36(4):688-694.

［12］SCHROER K，KITTELMANN M，L tz.Recombinant human cytochrome P450 monooxygenases for drug metabolite synthesis［J］.Biothchnology and Bioengineering，2010，106(5):699-706.

［13］SAKAKI T，INOUYE K.Practical application of mammalian cytochrome P450 ［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2000，90(6):583-590.

［14］BAKKEN G V，RUDBERG I，CHRISTENSEN H.Metabolism of quetiapine by CYP3A4 and CYP3A5 in presence or absence of cytochrome b5［J］.Drug Metabolism and Disposition，2009，37(2):254-258.

［15］MASIMIREMBWA C M，OTTER C，BERG M，et al.Heterologous expression and kinetic characterization of human cytochromes P-450:Validation of a pharmaceutical tool for drug metabolism research［J］.Drug Metabolism and Disposition，1999，27(10):1117-1122.

［16］DAVYDOV D R，HALPERT J R.Allosteric P450 mechanisms:multiple binding sites，multiple conformers or both?［J］.Drug Metab Toxicol，2008，4(12):1523-1535.

［17］CHEN Yakun，CHEN Shuqing，ZENG Su，et al.Glucuronidation of flavonoids by recombinant UGT1A3 and UGT1A9 ［J］.Biochemical Pharmacology，2008，76:416-425.

［18］YUAN R，MADANI S，WEI Xiaoxiong，et al.Evaluation of cytochrome P450 probe substrates commonly used by the pharmaceutical industry to study in vitro drug interactions ［J］.Drug Metabolism and Disposition，2002，30 (12):1311-1319.

［19］WANG R W，NEWTON D J，LIU Nini，et al.Human cytochrome P-450 3A4:in vitro drug-drug interaction patterns are substrate-dependent［J］.Drug Metabolism and Disposition，1999，28(3):360-366.

［20］EMOTO C，IWASAKI K.Approach to predict the contribution of cytochrome P450 enzymes to drug metabolism in the early drug-discovery stage:The effect of the expression of cytochrome b5with recombinant P450 enzymes ［J］.Xenobiotica，2007，37(9):986-999.

［21］DAI D，TANG J，ROSE R.Identification of variants of CYP3A4 and characterization of their abilities to metabolize testosterone and chlorpyrifos［J］.The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2001，299(3):825-831.

［22］MAEKAWA K，HARAKAWA N，YOSHIMURA T.CYP3A4* 16 and CYP3A4* 18 alleles found in east Asians exhibit differential catalytic activities for seven CYP3A4 ［J］.Drug Metabolism and Disposition，2010，38(12):2100-2104.

［23］MAEKAWA K，YOSHIMURA T，SAITO Y.Functional characterization of CYP3A4.16:catalytic activities toward midazolam and carbamazepine［J］.Xenobiotica，2009，39(2):140-147.

［24］PRATT-HYATT M，ZHANG Haoming，SNIDER N T.Effects of a commonly occurring genetic polymorphism of human CYP3A4(I118V)on the metabolism of anandamide ［J］.Drug Metabolism and Disposition，2010，38 (11):2075-2082.

［25］KONG L M，CHEN S Q，ZENG S，et al.Comparison of catalytical activity and stereoselectivity between the recombinant human cytochrome P450 2D6.1 and 2D6.10 ［J］.Pharmazie，2012，67:440-447.

［26］LIU Ting，HONG Yanjun，CHEN Shuqing，et al.An investigation of the catalytic activity of CYP2A13* 4 with coumarin and polymorphisms of CYP2A13 in a Chinese Han population ［J］.Drug Metabolism and Disposition，2012，40:847-851.

［27］CHEN Xuan，PAN Liqiang，CHEN Shuqing，et al.Influence of various polymorphic variants of cytochrome P450 oxidoreductase (POR)on drug metabolic activity of CYP3A4 and CYP2B6 ［J］.Plos One，2012，6(7):1-8.

［28］TAN P C S，HASSAN S K，MOHAMAD N A N.Cytochrome P450 3A4 genetic polymorphisms and post-operative fentanyl requirements［J］.Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics，2012，37:100-104.

［29］KLEIN K，THOMAS M，WINTER S.PPARA:a novel genetic determinant of CYP3A4 in vitro and in vivo［J］.Nature，2012，91(6):1044-1052.

［30］BJORNSSON T D，CALLAGHAN J T，EINOLF H J，et al.The conduct of in vitro and in vivo drugdrug interaction studies:A pharmaceutical research and manufacturers of America(PhRMA)［J］.Drug Metabolism and Disposition，2003，31(7):815-832.

［31］FOTI R S，ROCK D A，WIENKERS L C.Selection of alternative CYP3A4 probe substrates for clinical drug interaction studies using in vitro data and in vivo simulation ［J］.Drug Metabolism and Disposition，2010，38(6):981-987.

［32］FAHMI O A，MAURER T S，KISH M.A combined model for predicting CYP3A4 clinical net drugdrug interaction based on CYP3A4 inhibition，inactivation，and induction determined in vitro［J］.Drug Metabolism and Disposition，2008，36(8):1698-1708.

［33］US Food and Drug Administration.Guidance for Industry-Drug Metabolism/Drug Interaction Studies in the Drug Development Process:Studies In Vitro［M］.Rockville:Center for Drug Evaluation and Research，1997:4-5.