余欣尉， 吳 謙， 呂 望， 王 彥， 馬小瓊， 陳 喆*， 閻 超*

(1.上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310006）

根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，每年全球有上百萬(wàn)人死于肺癌。肺癌原位癌治愈率接近100%，但由于肺癌早期臨床表現(xiàn)不明顯，大部分患者確診時(shí)已屬晚期，只能采用姑息治療，預(yù)后較差，總的5年生存率約10%～15%［1］，因此，發(fā)展有效的早期診斷方法無(wú)疑能使患者盡早得到治療，明顯改善患者預(yù)后，延長(zhǎng)肺癌患者的生存時(shí)間。目前肺癌診斷的常用方法有影像學(xué)檢查方法、痰脫落細(xì)胞學(xué)檢查和支氣管鏡檢技術(shù)［2］，這些方法容易造成漏診與誤診，且儀器價(jià)格昂貴，不適合作為肺癌早期篩查手段。

近年來(lái)，隨著系統(tǒng)生物學(xué)的飛速發(fā)展，腫瘤標(biāo)志物的識(shí)別已成為惡性腫瘤早期診斷的研究熱點(diǎn)。腫瘤標(biāo)志物是指在腫瘤發(fā)生和增生過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞生物合成、釋放或者是腫瘤與宿主相互作用而產(chǎn)生的一類(lèi)物質(zhì)，其最終導(dǎo)致體內(nèi)的代謝物質(zhì)發(fā)生變化［3］。代謝組學(xué)可以對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的所有代謝物進(jìn)行定性和定量分析，并能識(shí)別未知代謝產(chǎn)物［4］。這種方法已經(jīng)成功地應(yīng)用于乳腺癌［5］、前列腺癌［6］的腫瘤標(biāo)志物識(shí)別中，對(duì)建立肺癌的早期診斷方法具有重要的參考價(jià)值。

目前肺癌早期標(biāo)志物的代謝組學(xué)研究主要通過(guò)對(duì)比肺癌病人與健康人的血液或尿液，但在很多代謝過(guò)程中，代謝產(chǎn)物個(gè)體差異大，極易受到飲食、環(huán)境、年齡和其他疾病等因素的干擾，在如此復(fù)雜的背景下識(shí)別疾病標(biāo)志物極有難度。而以腫瘤細(xì)胞作為代謝組學(xué)研究對(duì)象，通過(guò)細(xì)胞代謝物的差異表達(dá)尋找潛在的特異性疾病標(biāo)記物，可以避免常規(guī)實(shí)驗(yàn)中樣本個(gè)體差異與復(fù)雜性問(wèn)題，是一種極有前景的技術(shù)方法。Sheikh等［7］考察了細(xì)胞培養(yǎng)與提取方法對(duì)代謝物的影響，Gao等［8］考察了細(xì)胞脂質(zhì)代謝物的提取方法和條件，這些研究都為開(kāi)展細(xì)胞代謝組學(xué)研究提供了基礎(chǔ)，但相關(guān)研究國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。

本課題組以肺癌與對(duì)照細(xì)胞為樣本，采用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理手段，探索新的研究思路以識(shí)別疾病標(biāo)志物，同時(shí)與傳統(tǒng)肺癌代謝組學(xué)研究結(jié)果相互驗(yàn)證，為肺癌的早期診斷提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Paradigm MG4高效液相色譜儀(美國(guó)Michrom公司）;maXis UHR-TOF超高分辨四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司）;IEC MICROCL 17R微量冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司）;VXR旋渦混合器(德國(guó)IKA公司）;離心濃縮干燥器(太倉(cāng)市華美生化儀器廠(chǎng)）;25 cm2斜頸細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國(guó)BD Falcon公司）。

胎牛血清、McCoy's 5A培養(yǎng)液、DMEM(Dulbecco's modified eagle medium）高糖培養(yǎng)液、1640培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司）;甲醇、乙腈(HPLC級(jí)，德國(guó)Merck公司）;甲酸、醋酸銨(LC-MS級(jí)，瑞士 Fluka公司）;去離子水由 NANOpure超純水系統(tǒng)(美國(guó)Barnstead公司）制備。

1.2 細(xì)胞來(lái)源

人肺癌細(xì)胞 H358、A549、HCC827、H1299、Calu-3、Calu-1、PC-9和人正常胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

取Calu-1細(xì)胞使其貼壁生長(zhǎng)于含10%(體積分?jǐn)?shù)，下同）胎牛血清的 McCoy's 5A培養(yǎng)液中;取MRC-5細(xì)胞使其貼壁生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液中;取 H358、A549、HCC827、H1299、Calu-3、PC-9使其貼壁生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中;所有細(xì)胞均培養(yǎng)于25 cm2斜頸細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。將所有培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每種細(xì)胞平行培養(yǎng)6份，其中1份用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，另外5份用于細(xì)胞提取。

1.4 細(xì)胞提取方法

取一盒對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)基，用10 mL冰磷酸鹽緩沖液(PBS）清洗兩遍，液氮淬滅。在每盒細(xì)胞中加入0.75 mL甲醇-水(4∶1，v/v）溶液，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，置于1.5 mL離心管中。在液氮、37℃水浴中反復(fù)凍融兩次。加入3 μL 100 μg/mL L-2-氯苯丙氨酸(內(nèi)標(biāo)）與 3 μL 100 μg/mL溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine，LPC）12:0，加入0.45 mL二氯甲烷。置冰上，每5 min短暫渦旋一次，每次渦旋30 s，持續(xù)30 min。加入0.15 mL水促進(jìn)分層。在4℃下12000 r/min離心5 min，置于-20℃冰箱中過(guò)夜。將離心管上層與下層分別轉(zhuǎn)移至兩個(gè)新離心管中，旋干，上層用60 μL含0.1%甲酸的水溶液復(fù)溶，下層用60 μL含5 mmol/L醋酸銨的甲醇-水-甲酸(74∶25∶1，v/v/v）溶液復(fù)溶。分別進(jìn)樣分析。

1.5 上層提取物的色譜條件

C18 色譜柱(100 mm ×2.1 mm，3 μm，日本Shisedo公司）;流動(dòng)相A:含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相 B:含 0.1%甲酸的乙腈溶液;流速:200 μL/min。梯度洗脫程序:0～5 min 0%B，5～25 min 0～50%B，25～30 min 100%B;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:20 μL。

1.6 下層提取物的色譜條件

C18 色譜柱(100 mm ×2.1 mm，3 μm，日本Shiseido公司）;流動(dòng)相A:含5 mmol/L醋酸銨的甲醇-水-甲酸(74∶25∶1，v/v/v）;流動(dòng)相 B:含 5 mmol/L醋酸銨的甲醇-甲酸(99∶1，v/v）;梯度洗脫程序:0～10 min 50%B～100%B，10～30 min 100%B;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。

1.7 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI）正離子模式檢測(cè)，噴霧電壓:+4.5 kV;霧化氣壓:80 kPa;干燥氣流速:6.0 L/min;干燥氣溫度:200℃;碰撞池電壓(RF）:500 Vpp;質(zhì)量掃描范圍:m/z 50～1000;質(zhì)量校正液:1 mmol/L甲酸鈉。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

將HPLC-MS獲得的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)Bruker DataAnalysis 3.3軟件轉(zhuǎn)換成 NetCDF格式，導(dǎo)入metAlignTM軟件包進(jìn)行峰識(shí)別、峰對(duì)齊、基線(xiàn)矯正和峰面積歸一化法預(yù)處理。然后導(dǎo)入SIMCAP 11.5軟件進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析，在本實(shí)驗(yàn)中采用PLS-DA模型區(qū)別各組代謝物差異，通過(guò) R2X、R2Y、Q2參數(shù)值評(píng)價(jià)模型質(zhì)量，其中R2X、R2Y越接近1表示模型越穩(wěn)定，Q2＞0.5表示預(yù)測(cè)率高。根據(jù)PLS-DA模型得到的變量權(quán)重值(VIP）找到潛在的疾病生物標(biāo)志物，其中VIP＞1。為了驗(yàn)證多維統(tǒng)計(jì)中找到的差異物是否在單位統(tǒng)計(jì)上具有顯著差別，實(shí)驗(yàn)中采用 T檢驗(yàn)，其中 p＜0.05有顯著性差異［9］。通過(guò)差異物的精確質(zhì)荷比及同位素比例，在 HMDB(http://www.hmdb.ca/）和 METLIN(http://metlin.scripps.edu/）數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索可能的結(jié)構(gòu)式進(jìn)行推測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞提取方法的優(yōu)化

液液萃取是代謝物提取方法中常用的方法之一，Sana等［10］以血紅細(xì)胞為研究對(duì)象，系統(tǒng)考察了液液萃取過(guò)程中有機(jī)相和水相的性質(zhì)、兩相溶劑比例、水相pH等因素對(duì)提取到的化合物數(shù)量和實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)性的影響。Lorenz等［11］詳細(xì)考察了不同的淬滅方法、清洗溶劑、提取溶劑對(duì)INS-1細(xì)胞代謝物的提取效率與穩(wěn)定性的影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)文獻(xiàn)所述的樣品前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，采用液液萃取的方法，分別提取細(xì)胞極性代謝物與非極性代謝物。實(shí)驗(yàn)表明，用PBS進(jìn)行清洗，液氮淬滅有助于穩(wěn)定樣品代謝物。樣品在液氮及37℃水浴中反復(fù)凍融兩次，細(xì)胞可完全破碎。以甲醇-水-二氯甲烷(4∶2∶3，v/v/v）作為提取液，水相和有機(jī)相的互溶性最小，得到的細(xì)胞代謝物數(shù)量最多。此外，本實(shí)驗(yàn)中以二氯甲烷代替文獻(xiàn)中常用的氯仿，減少了萃取溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)人員與環(huán)境的危害。

2.2 分析條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中考察了流動(dòng)相性質(zhì)與洗脫梯度對(duì)樣品分離效果的影響。

細(xì)胞上層提取物主要為極性代謝物，適合使用含0.1%甲酸的乙腈-水流動(dòng)相體系。同時(shí)，比較了不同梯度(27 min、37 min、47 min）下的色譜分離情況，實(shí)驗(yàn)表明，采用1.5節(jié)所述的梯度條件對(duì)細(xì)胞極性代謝物樣品的分析速度適中，分離效果最佳。

細(xì)胞下層提取物主要為脂質(zhì)等非極性代謝物，這些物質(zhì)在色譜柱中的保留時(shí)間較長(zhǎng)，且難以洗脫。實(shí)驗(yàn)中考察了含5 mmol/L醋酸銨的甲醇-水-甲酸體系流動(dòng)相與含10 mmol/L醋酸銨的甲醇-水-甲酸體系流動(dòng)相對(duì)脂質(zhì)的洗脫能力，同時(shí)比較了不同梯度(27、37、47 min）下的色譜分離情況，實(shí)驗(yàn)表明，5 mmol/L醋酸銨流動(dòng)相體系下質(zhì)譜信號(hào)基線(xiàn)穩(wěn)定，峰形較好，采用1.6節(jié)所述的梯度條件能檢測(cè)到的色譜峰個(gè)數(shù)最多。

在最優(yōu)HPLC-MS分析條件下，分別對(duì)人肺癌細(xì)胞 H358、A549、HCC827、H1299、Calu-3、Calu-1、PC-9及人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5的極性代謝物與非極性代謝物進(jìn)行分析，得到不同細(xì)胞的代謝物指紋圖譜。在S/N=10時(shí)，8種細(xì)胞的極性代謝物譜圖分子特征峰個(gè)數(shù)在4000～6000之間，非極性代謝物譜圖分子特征峰個(gè)數(shù)比較接近，在2400～2600之間。較大的色譜峰容量為細(xì)胞代謝物的分析提供了豐富信息。圖1為典型的細(xì)胞極性和非極性代謝物譜圖。

圖1 H358細(xì)胞的(a）極性、(b）非極性代謝物譜圖Fig.1 Typical HPLC-MS base peak chromatograms of(a）polar metabolite profile and(b）non-polar metabolite profile of lung tumor cell H358

實(shí)驗(yàn)中以?xún)?nèi)標(biāo)物質(zhì)L-2-氯苯丙氨酸與保留時(shí)間為 6.46、7.70、10.30、26.32 min 的 5 個(gè)主要色譜峰的保留時(shí)間考察了極性代謝物層實(shí)驗(yàn)方法的重現(xiàn)性，譜峰保留時(shí)間的RSD均小于1.37%;同時(shí)以?xún)?nèi)標(biāo)物質(zhì) LPC 12:0 與保留時(shí)間為 11.49、16.31、20.11、24.23 min的5個(gè)主要色譜峰的保留時(shí)間考察了非極性代謝物層實(shí)驗(yàn)方法的重現(xiàn)性，譜峰保留時(shí)間的RSD均小于1.04%，表明實(shí)驗(yàn)所用方法具有較好的重現(xiàn)性。在優(yōu)化的色譜條件下，系統(tǒng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品L-2-氯苯丙氨酸和LPC 12:0的檢出限均為0.5 ng/mL。

實(shí)驗(yàn)中還考察了同一樣品在正、負(fù)離子兩種模式下的出峰情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞樣品在正離子模式下的色譜峰較多，獲得的信息量更多，且信號(hào)強(qiáng)度較大，因此選擇正離子模式對(duì)細(xì)胞代謝物進(jìn)行分析。

2.3 PLS-DA模型結(jié)果

在上述色譜條件下，分別對(duì)8種細(xì)胞的極性與非極性代謝物進(jìn)樣分析，采用PLS-DA模型進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析［11］。圖2分別為8種細(xì)胞的極性代謝物與非極性代謝物的PLS-DA得分圖。對(duì)于極性代謝物，該模型包含5個(gè)主成分，其擬合參數(shù)為R2X=0.779，R2Y=0.98，Q2=0.954;對(duì)于非極性代謝物，該模型包含3個(gè)主成分，其擬合參數(shù)為R2X=0.481，R2Y=0.983，Q2=0.974;說(shuō)明模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)率較高。

由圖2可見(jiàn)，在極性代謝物層與非極性代謝物層，人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5均與其他7種人肺癌細(xì)胞相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明非腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞代謝物有著顯著差異。在極性代謝物層，MRC-5細(xì)胞相對(duì)比較分散，其他各種腫瘤細(xì)胞組內(nèi)聚類(lèi)較好，這可能是由于人胚肺細(xì)胞分化程度低，而腫瘤細(xì)胞分化程度高，這與栗暉等［12］的研究結(jié)果一致。從圖2中還可以看出，無(wú)論是在極性代謝物層還是在非極性代謝物層，7種人肺癌細(xì)胞的代謝物之間也存在細(xì)微的差異，這種差異可能是由于各細(xì)胞不同的組織來(lái)源、形態(tài)和治療背景造成的。

2.4 代謝差異物

通過(guò)HMDB和METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)搜索差異物的精確質(zhì)荷比，對(duì)一些具有顯著性差異的物質(zhì)進(jìn)行了初步的結(jié)構(gòu)鑒別，獲得了10種細(xì)胞極性代謝差異物(見(jiàn)表1）與21種細(xì)胞非極性代謝差異物結(jié)構(gòu)信息(見(jiàn)表2）。

在腫瘤細(xì)胞的極性代謝物層，苯丙氨酸含量增加，纈氨酸、蛋氨酸、脯氨酸含量減少，與正常對(duì)照組相比均具有顯著性(p＜0.05），這可能是由于癌癥細(xì)胞的蛋白質(zhì)代謝紊亂造成的，該結(jié)果與肺癌患者血、尿代謝組學(xué)研究結(jié)論基本吻合［13-16］。

圖 2 人肺癌細(xì)胞 H358、A549、HCC827、H1299、Calu-3、Calu-1、PC-9及人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5的(a）極性、(b）非極性代謝物的PLS-DA分類(lèi)圖Fig.2 PLS-DA results of(a）polar-metabolites and(b）non-polar metabolites of lung tumor cell lines H358，A549，HCC827，H1299，Calu-3，Calu-1，PC-9 and normal cell line MRC-5

L-肉堿主要參與脂肪酸代謝，其主要功能是將脂肪酸從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線(xiàn)粒體進(jìn)行β-氧化，并以酰基肉堿的形式儲(chǔ)備能量。與對(duì)照組細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞的丁酰-L-肉堿與2-甲基丁?；鈮A含量顯著增加，這可能是由于腫瘤細(xì)胞快速?gòu)?fù)制導(dǎo)致脂肪酸的β-氧化下調(diào)造成的。

鞘氨醇是細(xì)胞生命活動(dòng)中的重要信號(hào)分子，通過(guò)神經(jīng)酰胺酶途徑與鞘氨醇激酶途徑直接參與細(xì)胞的增殖與凋亡調(diào)控。正常細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)酰胺、鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇水平通過(guò)動(dòng)態(tài)平衡維持細(xì)胞的正常生理功能。與對(duì)照組細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞的鞘氨醇含量顯著增加，提示在腫瘤細(xì)胞中神經(jīng)酰胺、鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇的動(dòng)態(tài)平衡被打破，這可能是由于鞘氨醇激酶途徑被異常激活。鞘氨醇激酶途徑的異常激活與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有密切關(guān)系［17］。

在腫瘤細(xì)胞的非極性代謝物層，多種卵磷脂和縮醛磷脂含量有不同程度的上調(diào)，Cer d42:2以及多種鞘磷脂水平明顯下調(diào)，提示腫瘤細(xì)胞磷脂代謝通路發(fā)生紊亂。卵磷脂水平增高可能是由于腫瘤細(xì)胞能通過(guò)胞苷二磷酸膽堿途徑合成高含量不飽和脂肪酸的卵磷脂?？s醛磷脂是存在于哺乳動(dòng)物組織內(nèi)含烯醚鍵的甘油磷脂，據(jù)文獻(xiàn)［18］報(bào)道，在腫瘤組織中縮醛磷脂水平增高，其原因可能與多種參與合成或降解縮醛磷脂的酶活性改變相關(guān)，包括磷酸二羥丙酮脂酰轉(zhuǎn)酶、磷脂酰胞苷轉(zhuǎn)移酶、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D。鞘磷脂主要存在于細(xì)胞膜、脂蛋白和其他富含脂類(lèi)的組織結(jié)構(gòu)上，鞘磷脂在鞘磷脂酶的作用下水解生成神經(jīng)酰胺。神經(jīng)酰胺是細(xì)胞凋亡過(guò)程中常見(jiàn)的第二信使分子，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，神經(jīng)酰胺能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，如U937和JB6腫瘤細(xì)胞等［19，20］。

表1 肺癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的極性代謝差異物鑒定結(jié)果Table 1 Summary of the differential polar metabolites between lung tumor cell lines and normal cell line

表2 肺癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的非極性代謝差異物鑒定結(jié)果Table 2 Summary of the differential non-polar metabolites between lung tumor cell lines and normal cell line

實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞LPC 18:1含量下調(diào)，這與許多癌癥代謝組學(xué)的文獻(xiàn)［21-23］報(bào)道一致。LPC在血液中主要受溶血磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)移酶與磷脂酶調(diào)控，有研究表明，在直腸癌患者體內(nèi)溶血磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)移酶被過(guò)度表達(dá);另外，癌癥患者磷脂酶活性增高均可能導(dǎo)致LPC降低。

3 結(jié)論

本文提出了一種同時(shí)提取細(xì)胞極性與非極性代謝產(chǎn)物的方法，并采用HPLC-MS技術(shù)對(duì)7種人肺癌細(xì)胞 H358、A549、HCC827、H1299、Calu-3、Calu-1、PC-9及人正常胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5進(jìn)行分析，獲得了8種細(xì)胞的代謝物圖譜，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析手段研究了腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的圖譜變化情況，結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的代謝物譜圖有顯著變化。通過(guò)對(duì)一些具有顯著性差異的物質(zhì)進(jìn)行初步鑒定，得到了10種極性代謝差異物與21種非極性代謝差異物。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞在蛋白質(zhì)代謝、脂肪酸代謝、磷脂代謝方面發(fā)生不同程度的紊亂，與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道情況基本相符，證明通過(guò)細(xì)胞代謝物的差異表達(dá)來(lái)尋找潛在疾病標(biāo)志物是一種極有前景的手段，與傳統(tǒng)的以病人血液、尿液為樣本的代謝組學(xué)研究相互佐證與補(bǔ)充。進(jìn)一步還可以動(dòng)物模型和組織為樣本，采用本文的方法對(duì)極性代謝差異物和非極性代謝差異物進(jìn)行分析和驗(yàn)證，以期為研究癌癥疾病機(jī)制、篩查或治療提供一種新的有效平臺(tái)。

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