廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 劉 誠

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 黎滿香

寧鄉(xiāng)縣畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局 盧 帥

抗菌肽是一類具有多種生物學(xué)功能的小分子多肽，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，是動(dòng)物天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分。據(jù)目前所知，抗菌肽殺菌和抑菌的機(jī)理有很多，但主要均是通過與膜的相互作用實(shí)現(xiàn)的，其中包括改變通透性，破壞膜結(jié)構(gòu)以及干撓膜成分的合成等。這一獨(dú)特的機(jī)理使其具有抗菌譜廣泛、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，且對(duì)于目前已產(chǎn)生耐藥性的菌株同樣可發(fā)揮作用（Zasloff，2002）。

兩棲動(dòng)物葉水蛙 （Phyllomedusa distincta）在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，為適應(yīng)生存環(huán)境，其皮膚可分泌許多結(jié)構(gòu)特殊、功能多樣的抗菌肽類物質(zhì)，用以抵抗病原體的侵襲（Suh等，1996），抗菌肽Dermadistinctin-Q1（DDQ1）就是其中一類。

抗菌肽在生物體內(nèi)含量較低，難以直接提取，且對(duì)于高等生物源抗菌肽無法實(shí)現(xiàn)?；瘜W(xué)合成雖可獲得與天然抗菌肽一致的氨基酸序列，但其成本過高，且會(huì)存在有害物質(zhì)殘留。目前，利用基因工程途徑合成抗菌肽是一個(gè)理想的選擇。本試驗(yàn)通過原核表達(dá)系統(tǒng)制備抗菌肽DDQ1，并對(duì)其生物活性以及其對(duì)溫度、酸堿度的耐受性進(jìn)行測(cè)定，以期為制備和深入研究抗菌肽DDQ1提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a（+）、基因工程菌E.coli BL21 （DE3）pLysS和 E.coli DH5α，均購自默克化工技術(shù)（上海）有限公司；金黃色葡萄球菌（10384）、枯草芽孢桿菌（21744），購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；綠膿桿菌、豬鏈球菌2型和炭疽桿菌，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)分子免疫學(xué)與微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、DNA分子量Marker，均購自寶生物工程（大連）有限公司；蛋白質(zhì)分子量Marker，購自Fermentas公司；Taq PCR Mastermix、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司；腸激酶（Z01003），購自南京金斯瑞生物科技有限公司；其他試劑均為分析純級(jí)產(chǎn)品。

1.3 合成DDQ1基因和構(gòu)建原核表達(dá)載體 從GenBank中獲取抗菌肽DDQ1氨基酸序列（No.P83641.1），利用DNAStar軟件，使用大腸桿菌偏好性密碼子（Hoffmann等，1996）設(shè)計(jì)3條PCR引物（表1）。其中，P1的5'端添加有Sac I和腸激酶酶切位點(diǎn)，P3的5'端添加有Hind III和腸激酶酶切位點(diǎn)。引物均由廣州英駿生物有限公司合成。

表1 抗菌肽DDQ1基因的PCR引物

采用重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法，多步PCR獲得抗菌肽DDQ1全基因。先以P1和P2為引物擴(kuò)增DDQ1前半部分序列DDQ1-Q，再以DDQ1-Q為模板，P1和P3為引物擴(kuò)增獲得DDQ1全基因。反應(yīng)體系（50 μL）： 2×Taq PCR Mastermix 25 μL，上游引物和下游引物各 1.0 μL，滅菌水 23 μL。

PCR程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次；72℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后使用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行DNA電泳分析，產(chǎn)物置于-20℃保存。

使用Sac I酶和Hind III酶對(duì)PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a（+）同時(shí)進(jìn)行雙酶切操作。純化酶切產(chǎn)物后，將DDQ1全基因片段與pET-32a（+）質(zhì)粒連接，并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α中。利用氨芐西林（Amp）挑選疑似陽性菌，由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序確認(rèn)。將陽性菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，使用質(zhì)粒抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒P-DDQ1。最終將 P-DDQ1轉(zhuǎn)化至 E.coli BL21（DE3）pLysS中，即為 E-DDQ1。

1.4 誘導(dǎo)表達(dá)E-DDQ1及條件優(yōu)化

1.4.1 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間優(yōu)化 選取在氨芐西林（Amp）LB固態(tài)培養(yǎng)基上的單個(gè)陽性菌落，振蕩培養(yǎng)過夜。翌日，以1∶100體積比轉(zhuǎn)移至20 mL添加0.1%氨芐西林（Amp）的LB液態(tài)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，直至OD600nm值達(dá)到0.5～0.6時(shí)，按照1.0 mmol/L終濃度添加IPTG誘導(dǎo)E-DDQ1表達(dá)。從添加IPTG起，每隔1 h取樣1 mL，采集0 h和1～7 h樣品。將所得的8個(gè)樣品于12000 r/min離心5 min收集菌體，加入純水和2×Loading Buffer各50 μL，充分混合均勻后，沸水浴5 min。分別取處理后的樣品各20 μL，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.4.2 IPTG誘導(dǎo)濃度優(yōu)化 選取在氨芐西林（Amp）LB固態(tài)培養(yǎng)基上的單個(gè)陽性菌落，振蕩培養(yǎng)過夜。翌日，以1∶100體積比轉(zhuǎn)移至3 mL添加0.1%氨芐西林（Amp）的LB液態(tài)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，直至OD600nm值達(dá)到0.5～0.6時(shí)，按照不同終濃 度 （0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L） 添 加IPTG誘導(dǎo)E-DDQ1表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間按照1.4.1結(jié)果確定，每個(gè)濃度梯度取樣1 mL。將所得的7個(gè)樣品于12000 r/min離心5 min收集菌體，加入純水和 2×Loading Buffer各 50 μL， 充分混合均勻后，沸水浴5 min。分別取處理后的樣品各20 μL，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.5 抗菌肽DDQ1獲取及純化 根據(jù)1.4確定的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件，在200 mL的LB液態(tài)培養(yǎng)基中大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。于4℃下5000 r/min離心10 min收集菌體，使用PBS清洗3次后超聲波裂解菌體。因預(yù)試驗(yàn)鑒定融合蛋白為可溶蛋白形式，于12000 r/min離心15 min后收集上清液。

按下述酶切體系對(duì)融合蛋白進(jìn)行酶切：10×Buffer 10.0 μL，滅菌水 38.0 μL，融合蛋白 50.0 μL，腸激酶 2.0 μL，置于23℃下20 h。

利用Thermo Scientific公司的HisPur Ni-NTA Spin Purification Kit進(jìn)行抗菌肽DDQ1的純化。按說明書預(yù)處理樹脂柱后，加入與High-capacity nickel-IMAC resin等量的酶切處理過的上清液，置于4℃環(huán)境中結(jié)合1 h后，梯度洗脫目的蛋白，分段收集洗脫液。使用Bradford法檢測(cè)抗菌肽DDQ1溶液濃度（汪家政和范明，2005）。

1.6 抗菌肽DDQ1生物活性檢測(cè)

1.6.1 最小抑菌濃度 （MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測(cè)定 使用微量稀釋法測(cè)定抗菌肽DDQ1對(duì)E.coli DH5α、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、綠膿桿菌 （Pseudomonas aeruginosa）、 豬鏈球菌 2型（Streptococcus suis 2） 和炭疽桿菌 （Bacillus anthracis）的MIC和MBC。具體試驗(yàn)步驟如下：將試驗(yàn)菌株制備成106cfu/mL的菌液，分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔90 μL。使用PBS將抗菌肽DDQ1溶液分別稀釋成 40.0、20.0、10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0.5 μg/mL，并加入 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔10 μL。設(shè)置空白對(duì)照組為僅含LB液態(tài)培養(yǎng)基，條件對(duì)照組為僅含有試驗(yàn)菌株的菌液，酶切對(duì)照組為添加有未經(jīng)腸激酶處理的融合蛋白溶液和試驗(yàn)菌株的菌液。置于37℃培養(yǎng)箱中過夜，翌日測(cè)定每孔的OD600nm值。可完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低溶液濃度即為抗菌肽DDQ1對(duì)該試驗(yàn)菌株的MIC。將抗菌肽DDQ1溶液濃度大于MIC的各組按1∶100比例接種LB液態(tài)培養(yǎng)基，并取其中100 μL均勻涂布在LB固態(tài)培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱中12 h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。固態(tài)培養(yǎng)基上少于5個(gè)菌落的最高溶液濃度即為抗菌肽DDQ1對(duì)該試驗(yàn)菌株的MBC。

1.6.2 溫度、酸堿度對(duì)抗菌肽DDQ1生物活性的影響 將抗菌肽DDQ1溶液置于100℃或-80℃環(huán)境中，按1.6.1方法測(cè)定不同時(shí)間長(zhǎng)度（10、20、30、60、120、180、240 min） 抗菌肽 DDQ1對(duì) E.coli DH5α的MIC值。

分別調(diào)節(jié)抗菌肽DDQ1溶液的pH為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，按照1.6.1方法測(cè)定不同pH條件下抗菌肽DDQ1對(duì)E.coli DH5α的MIC值。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽DDQ1的全基因PCR擴(kuò)增 分別取兩次PCR的產(chǎn)物各10 μL，使用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行DNA電泳分析。由圖1可見，100～250 bp間有特異條帶，符合預(yù)期結(jié)果，即為目的基因片段。

2.2 測(cè)序 經(jīng)深圳華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序，確認(rèn)所獲得的DDQ1全基因序列與試驗(yàn)設(shè)計(jì)完全一致。

2.3 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間和IPTG濃度的優(yōu)化 由圖2可見，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為0 h，未見融合蛋白表達(dá)；當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為1 h，可見融合蛋白開始表達(dá)；2～5 h，融合蛋白表達(dá)量隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加；當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為6 h，融合蛋白表達(dá)量未見增加。由此可以推測(cè)融合蛋白在IPTG誘導(dǎo)5 h后，其表達(dá)量達(dá)到頂峰。因此，最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間確定為5 h。

圖1 抗菌肽DDQ1的全基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 抗菌肽DDQ1融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間優(yōu)化

按照不同終濃度添加IPTG誘導(dǎo)E-DDQ1表達(dá) ，IPTG終濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L。由圖3可見，各組融合蛋白表達(dá)量相近，未有顯著差異。因此，最佳誘導(dǎo)IPTG濃度確定為0.1 mmol/L。

圖3 抗菌肽DDQ1融合蛋白IPTG誘導(dǎo)濃度優(yōu)化

2.4 抗菌肽DDQ1的純化 收集融合蛋白后，使用腸激酶酶切處理，并通過Ni離子親和層析法獲得純化的抗菌肽DDQ1溶液。由圖4可見，經(jīng)過純化處理后，在1.7～4.6 kD有明顯的蛋白條帶，符合試驗(yàn)設(shè)計(jì)大小，即為抗菌肽DDQ1。通過Bradford法測(cè)定純化后抗菌肽DDQ1溶液的蛋白濃度為 265.75 μg/mL。

圖4 Ni離子親和層析法純化抗菌肽DDQ1

2.5 抗菌肽DDQ1生物活性檢測(cè)

2.5.1 抗菌肽DDQ1的MIC和MBC 使用微量稀釋法測(cè)定抗菌肽DDQ1對(duì)于E.coli DH5α、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、豬鏈球菌2 型和炭疽桿菌的 MIC 分別為 1.0、2.0、2.0、0.5、2.0、4.0 μg/mL；MBC 分別為 2.0、4.0、4.0、1.0、4.0、8.0 μg/mL。未經(jīng)腸激酶處理的融合蛋白針對(duì)所有試驗(yàn)菌株均不表現(xiàn)出生物活性。

2.5.2 溫度對(duì)抗菌肽DDQ1生物活性的影響 由圖5可見，抗菌肽DDQ1置于100℃下隨時(shí)間延長(zhǎng)生物活性逐漸下降，但仍保持較高的生物活性，且在30 min內(nèi)幾乎無變化。當(dāng)置于-80℃下隨時(shí)間延長(zhǎng)同樣可造成生物活性逐漸下降，且在60 min內(nèi)幾乎無變化?？梢?，高溫對(duì)抗菌肽DDQ1的影響強(qiáng)于低溫。

圖5 抗菌肽DDQ1置于100℃或-80℃下隨時(shí)間延長(zhǎng)生物活性的變化

2.5.3 酸堿度對(duì)抗菌肽DDQ1生物活性的影響由圖6可見，在酸性和中性環(huán)境下，抗菌肽DDQ1的生物活性較為穩(wěn)定，環(huán)境酸堿度變化對(duì)其幾乎無影響。當(dāng)pH為6.0時(shí)，抗菌肽DDQ1的生物活性最高。當(dāng)pH為9.0時(shí)，抗菌肽DDQ1的生物活性開始降低，且隨著pH上升，其受到的影響程度逐漸加大。

3 討論

圖6 抗菌肽DDQ1在不同酸堿度環(huán)境中生物活性的變化

本試驗(yàn)采用重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法，通過設(shè)計(jì)3條末端互補(bǔ)的PCR引物，分兩步合成抗菌肽DDQ1全基因。其末端帶有的Sac I和Hind III酶切位點(diǎn)為構(gòu)建原核表達(dá)載體提供黏性末端；腸激酶酶切位點(diǎn)可將抗菌肽DDQ1從融合蛋白中分離；His標(biāo)簽則使抗菌肽DDQ1通過Ni離子親和層析法純化成為可能。

絕大多數(shù)生物均具備某種程度的密碼子偏好性，大腸桿菌極少利用TAG等8個(gè)密碼子（鄭彬瓊，2009）。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物均由大腸桿菌利用頻率較高的密碼子構(gòu)成，以期在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)密碼子最佳化，從而進(jìn)行高水平表達(dá)。

E.coli BL21 （DE3）pLysS 是 在 E.coli BL21（DE3）基礎(chǔ)上改造后獲得的，其額外附帶有pLysS質(zhì)粒，可通過編碼T7溶菌酶，降低位于T7啟動(dòng)子后方的目的基因表達(dá)背景，但對(duì)于IPTG誘導(dǎo)效果無影響。

pET-32a（+）原核表達(dá)質(zhì)粒中帶有硫氧還蛋白（Trx）標(biāo)簽（王媛媛等，2008），可促進(jìn)表達(dá)高產(chǎn)量的可溶性融合蛋白，并能催化蛋白質(zhì)二硫鍵還原，幫助蛋白質(zhì)正確折疊。因抗菌肽DDQ1分子量較小，僅占融合蛋白的15.4%，對(duì)其進(jìn)行融合表達(dá)既能實(shí)現(xiàn)融合蛋白的可溶性表達(dá)，又能避免蛋白酶作用，提高穩(wěn)定性 （Hsu等，2013；Wang等，2013）。

本試驗(yàn)體外檢測(cè)了抗菌肽DDQ1的生物活性，其對(duì)以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌、以豬鏈球菌2型為代表的革蘭氏陽性菌和目前耐藥性最嚴(yán)重的金黃色葡萄球菌均具有生物活性，說明抗菌肽DDQ1具有廣譜抗菌活性。

抗菌肽的穩(wěn)定性是其能否替代抗生素的關(guān)鍵?？咕腄DQ1的生物活性在強(qiáng)酸環(huán)境下幾乎無影響，說明其具備較強(qiáng)的酸耐受性，可適應(yīng)胃內(nèi)強(qiáng)酸環(huán)境。100℃下處理30 min對(duì)抗菌肽DDQ1的生物活性無顯著影響，更長(zhǎng)時(shí)間的處理也僅造成生物活性略微下降，仍保持較高水平，說明抗菌肽DDQ1具備一定的熱耐受性，可承受飼料加工過程的高溫。

綜上所述，抗菌肽DDQ1具備較強(qiáng)的廣譜抗菌活性，可抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，同時(shí)又具有較強(qiáng)的熱、酸耐受性，可經(jīng)受飼料加工過程和胃內(nèi)強(qiáng)酸環(huán)境。因此，抗菌肽DDQ1是一類極具開發(fā)潛力的新型抗菌藥物，其在食品防腐、疾病治療等方面具有良好的應(yīng)用前景。

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