蔣志麗 李艷芳* 曹芳芳 劉 飛 白雪源 呂 楊

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心內(nèi)科，北京100029;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院心外科，北京100037;3.解放軍總醫(yī)院腎科，北京100853)

α1－AR和β－AR在調(diào)節(jié)肺臟血流、支氣管平滑肌的舒縮及肺泡液體清除等方面有著重要作用［1－2］，但有關(guān)腎上腺素能受體各亞型在心力衰竭肺臟表達(dá)水平變化的報(bào)道較少，為此，我們采用心肌梗死后心力衰竭大鼠肺臟進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)近交系Wistar大鼠，雄性，10周齡，體質(zhì)量250～280 g，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK－(軍)2007－004。動(dòng)物房溫度維持在(22±3)℃，相對(duì)濕度為(50±20)%。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

抗 α1A－AR 和抗 β1－AR，β2－AR 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3 心肌梗死后心力衰竭模型制作

大鼠稱(chēng)體質(zhì)量后以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉，備皮，仰臥固定，行氣管插管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)(潮氣量10 mL/kg，呼吸頻率80次/min，吸呼比1∶1)，監(jiān)測(cè)心電圖。常規(guī)強(qiáng)力碘消毒，于胸骨左側(cè)第4肋間開(kāi)一橫切口，暴露心臟，由左心耳下方2～3 mm結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。結(jié)扎即刻心電監(jiān)護(hù)顯示肢導(dǎo) R 波振幅明顯升高，隨后 I、II、III、avL、avF 和 V3導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高＞0.2 mv，并呈動(dòng)態(tài)演變過(guò)程，1周時(shí)復(fù)查心電圖可見(jiàn)病理性Q波為心肌梗死模型制作成功，心肌梗死4周后做超聲心動(dòng)圖檢測(cè)示左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)≤45%為心力衰竭模型成功標(biāo)志［3］。

1.4 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能

檢測(cè)前以1%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔麻醉大鼠，胸部備皮，仰臥固定。探頭置于胸前，探頭頻率10 mHz，圖像深度2.5cm。取胸骨旁左室長(zhǎng)軸及短軸切面進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量參數(shù)包括左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular diastolic diameter，LVDD)，左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter，LVSD)，左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)，每項(xiàng)指標(biāo)均測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期，結(jié)果取平均值。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及組織提取

35只雄性Wistar大鼠，分為正常對(duì)照組(10只)和假手術(shù)組(10只)，其余15只大鼠制作心肌梗死模型，心肌梗死4周后心力衰竭模型制作成功10只，繼續(xù)喂養(yǎng)8周后存活9只。將以上3組大鼠以1%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，開(kāi)胸取肺組織，立即置于－80℃冰箱保存待測(cè)。

1.6 Western blotting

采用 Western blotting 法檢測(cè)肺組織 α1A－AR、β1－AR、β2－AR的蛋白表達(dá)水平。1)組織裂解:提取肺組織質(zhì)組織總蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。2)SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制:5%積層膠+10%分離膠。3)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳:用微量加樣器吸取蛋白質(zhì)樣品，按預(yù)定的順序加入加樣孔，上樣量約每孔100 μg(β－actin為內(nèi)參照);以100v進(jìn)行恒壓電泳2 h，直到溴芬藍(lán)到達(dá)分離膠底部。4)轉(zhuǎn)膜:采用硝酸纖維素膜，石墨電極半干轉(zhuǎn)，以恒流1 mA/cm2凝膠電泳轉(zhuǎn)移1 h;用麗春紅染液對(duì)硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行染色。5)免疫印跡顯色:將結(jié)合蛋白的硝酸纖維素膜放入塑料袋加入封閉液置于4℃冰箱過(guò)夜;根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)加入一抗，各受體亞型一抗的稀釋濃度分別為 α1A－AR:1 ∶200;β1－AR:1 ∶200;β2－AR:1∶100;室溫2 h，TBST 洗膜;按1 ∶2 000 加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗，置于37℃搖床溫育45 min，TBST洗膜;于硝酸纖維素膜上滴加DAB液，膠片顯影。用掃描儀對(duì)膠片進(jìn)行掃描成像。應(yīng)用吸光度分析測(cè)定蛋白的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Quantity one軟件對(duì)圖像進(jìn)行吸光度分析，以目的條帶與內(nèi)參照條帶信號(hào)強(qiáng)度的比值代表組織中目的受體的表達(dá)水平。用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，如樣本間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用Newman－Keuls檢驗(yàn)法進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 α1A-AR蛋白表達(dá)水平的改變

α1A－AR蛋白在A組、B組和C組的表達(dá)水平分別為0.52±0.11，0.49±0.08，0.36±0.06，C 組與 B 組相比出現(xiàn)顯著下調(diào)(P＜0.05)，A組與B組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖1，表1)。

2.2 β1-AR和β2-AR蛋白表達(dá)水平的改變

β1－AR蛋白在A組、B組和C組的表達(dá)水平分別為0.34±0.06，0.35±0.07，0.27±0.04，C 組與 B 組相比出現(xiàn)顯著下調(diào)(P＜0.05)，A組與B組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖1，表1)。

β2－AR蛋白在A組、B組和C組的表達(dá)水平分別為0.30±0.06，0.31±0.05，0.46±0.08，C 組與 B 組相比出現(xiàn)顯著上調(diào)(P＜0.01)，A組與B組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(圖1，表1)。

圖1 各組α1A-AR，β1-AR，β2-AR在肺臟中的蛋白表達(dá)水平Fig.1 Expression of α1A-AR，β1-AR and β2-AR subtypes protein levels in the lung of each group

表1 各組大鼠肺臟α1A-AR和β-AR，β2-AR各亞型的蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression of α1A-AR，β1-AR and β2-AR subtypes protein levels in the lung of each group

3 討論

腎上腺素受體分為 α－AR和 β－AR 2種類(lèi)型，α－AR 分為 α1－AR 和 α2－AR 2 大類(lèi)，α1－AR 又分為 α1AAR、α1B－AR、α1D－AR 3 種亞型，β－AR 分為 β1－AR、β2－AR、β3－AR 3 種亞型。肺臟組織中 α1A－AR、α1B－AR、α1D－AR 3 種亞型均有表達(dá)，但以 α1A－AR 的表達(dá)為主［2，4］。α1A－AR 參與肺臟血管收縮，并與 β2－AR 共同調(diào)節(jié)肺臟通氣/血流比值。但也有研究［5］認(rèn)為，α1BAR和 α1D－AR在肺臟動(dòng)脈收縮中起著一定作用。α1B－AR、α1D－AR 和 α2－AR 還參與肺臟靜脈收縮的調(diào)節(jié)［6］。大鼠肺臟組織中 β1－AR、β2－AR、β3－AR 3 種亞型均有表達(dá)［7］，但 β2－AR 在其中占主導(dǎo)地位，是調(diào)節(jié)肺臟生理功能的主要受體亞型。β1－AR、β2－AR 不僅分布于肺臟呼吸道上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞上，而且在肺血管平滑肌上也有表達(dá)，β1－AR、β2－AR 的表達(dá)隨著支氣管管徑逐漸變細(xì)而表達(dá)數(shù)量逐漸增多，β2－AR所占的比例也逐漸增大。肺泡上皮中表達(dá)的β－AR幾乎全部是 β2－AR［8－9］。激動(dòng)肺臟 β2－AR 會(huì)導(dǎo)致支氣管平滑肌舒張、肺泡液體清除率增加、肺組織鈉離子通道的開(kāi)放等［8］。在肺泡性低氧血癥、氧化應(yīng)激損傷等情況下，α－AR和β－AR表達(dá)水平發(fā)生變化，以適應(yīng)病理狀態(tài)下的肺臟功能。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，慢性心力衰竭大鼠肺臟 α1A－AR、β1－AR 表達(dá)水平顯著下調(diào)，而 β2－AR顯著上調(diào)。這與慢性心力衰竭大鼠心臟α1－AR和β－AR 表達(dá)水平改變不同。多數(shù)研究［10－13］顯示慢性心力衰竭心臟 β1－AR 下調(diào)，α1A－AR 上調(diào)［9－12］。而目前有關(guān)β2－AR在心力衰竭時(shí)的變化則眾說(shuō)紛紜，Mwtlu等［14］認(rèn)為，慢性心力衰竭時(shí)心臟 β2－AR 表達(dá)不變，但Du等［12］認(rèn)為，心力衰竭心臟 β2－AR 下調(diào)。有關(guān)心力衰竭肺臟腎上腺素受體表達(dá)的變化迄今為止尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)，慢性心力衰竭肺臟 β1－AR、α1A－AR均下調(diào)，β2－AR上調(diào)，在國(guó)內(nèi)外尚屬首例。肺臟與心臟表達(dá)水平不一致的原因可能與分布于不同器官的腎上腺素受體介導(dǎo)不同的生理功能有關(guān)。分布在心臟的 β1－AR、β2－AR 激動(dòng)后產(chǎn)生心肌的正性變時(shí)、變力作用。心力衰竭時(shí)，交感－腎上腺素系統(tǒng)被激活，導(dǎo)致心臟的 β1－AR和 β2－AR被蛋白激酶 A和 β－AR激酶磷酸化而脫敏或由于受體mRNA表達(dá)水平減少而下調(diào)［10，15－17］，進(jìn)而受體對(duì)激動(dòng)劑的反應(yīng)性減弱，興奮－收縮脫耦聯(lián)，出現(xiàn)心肌收縮力下降。激動(dòng)心臟的α1AAR可介導(dǎo)心臟的正性變力效應(yīng)［11］，慢性心力衰竭時(shí)心臟的α1A－AR代償性上調(diào)，力圖發(fā)揮增強(qiáng)心肌收縮力、抑制細(xì)胞凋亡，防止心肌重塑的作用［12］。與心臟α－AR和β－AR表達(dá)水平的改變有所不同，在肺臟發(fā)揮生理功能的受體主要是 α1－AR和 β2－AR。生理情況下，肺循環(huán)系統(tǒng)的β2－AR作用占優(yōu)勢(shì)，有利于肺血管舒張和抑制平滑肌增生［9］;CHF肺循環(huán)淤血，肺靜脈壓升高，肺毛細(xì)血管擴(kuò)張，左心衰初期的肺靜脈壓升高會(huì)被肺毛細(xì)血管網(wǎng)緩沖，不會(huì)即刻引起肺動(dòng)脈高壓。只有左心功能不全加重，導(dǎo)致長(zhǎng)時(shí)間的肺靜脈高壓，超過(guò)肺毛細(xì)血管網(wǎng)的緩沖能力，才會(huì)影響肺動(dòng)脈壓力，出現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓和右心功能不全。本研究中，和假手術(shù)組相比，心衰模型組α1A－AR表達(dá)明顯下調(diào)，究其原因，一方面因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑樾募」Ｋ篮笮牧λソ叽笫竽Ｐ?，主要累及左心功能，尚未發(fā)展到右心功能不全，另一方面α1A－AR下調(diào)可能是機(jī)體的一種代償反應(yīng)，α1A－AR的下調(diào)能舒張肺小動(dòng)脈、抑制血管平滑肌的增生，從而延緩肺小動(dòng)脈收縮導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的進(jìn)程，對(duì)右心功能起到保護(hù)作用。心力衰竭時(shí)，肺臟β2－AR表達(dá)上調(diào)一方面可以進(jìn)一步發(fā)揮舒張血管和支氣管平滑肌作用，而且激動(dòng)β2－AR能夠通過(guò)開(kāi)放鈉離子通道等機(jī)制促進(jìn)肺水腫液的清除、并能改善心力衰竭條件下肺臟微血管的通透性［13］。心力衰竭時(shí)肺臟β1－AR的下調(diào)一方面與慢性心力衰竭時(shí)交感腎上腺素系統(tǒng)激活產(chǎn)生的負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)，另一面也與代償性拮抗β2－AR的上調(diào)，維持相對(duì)穩(wěn)定的肺泡液體清除率有關(guān)。

綜上所述，心力衰竭時(shí)肺臟腎上腺素受體的變化是為了適應(yīng)肺臟病理變化的需求，因此，對(duì)于心力衰竭時(shí)保護(hù)肺臟的治療應(yīng)以局部激動(dòng)β2－AR及阻滯α1A－AR為主，這與調(diào)節(jié)心力衰竭時(shí)心臟腎上腺素受體表達(dá)水平變化的治療方案不同。

［1］Nováková M，Myslivecek J.Identification of all α1－adrenoceptor subtypes in rat lung［J］.Gen Physiol Biophys，2005，24(3):349－353.

［2］Michelotti G A，Price D T，Schwinn D A. α1－Adrenergic receptor regulation:basic science and clinical implications［J］.Pharmacol Ther，2000，88(3):281－309.

［3］吳振軍.心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡與肺血管結(jié)構(gòu)改變及藥物干預(yù)的研究［M］.北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2004:48－50.

［4］吳虹，孫銀香.α1－腎上腺素受體亞型的分布及特點(diǎn)［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27(12):1728－1730.

［5］OriowoM A，ChandrasekharB，KadavilE A. α1－adrenoceptor subtypes mediating noradrenaline－induced contraction of pulmonary artery from pulmonary hypertensive rats［J］.Eur J Pharmacol，2003，482(1－3):255－263.

［6］G?rnemann T，Villalón CM，Centurión D，et al.Phenylephrine contracts porcine pulmonary veins viaα1B－，α1D－，and α2－adrenoceptors［J］.Eur J Pharmacol，2009，613(1－3):86－92.

［7］Mak J C，Nishikawa M，Haddad E B，et al.Localisation and expression of β－adrenoceptor subtype mRNAs in human lung［J］.Eur J Pharmacol，1996，302(1－3):215－221.

［8］Abraham G，Kottke C，Dhein S，et al.Pharmacological and biochemical characterization of the beta－adrenergic signal transduction pathway in different segments of the respiratory tract［J］.Biochem Pharmacol，2003，66(6):1067－1081.

［9］Abraham G，Shibeshi W，Ungemach FR.Identification and characterization of β－adrenergic receptors in isolated primary equine tracheal epithelial cells［J］.Pulm Pharmacol Ther，2011，24(1):174－181.

［10］王慶祥，陳國(guó)忠.β3受體與心力衰竭相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008，14(18):2730－2732.

［11］Jensen B C，O'Connell T D，Simpson P C.Alpha－1－adrenergic receptors:targets for agonist drugs to treat heart failure［J］.J Mol Cell Cardiol，2011，51(4):518－528.

［12］Du X J，Gao X M，Kiriazis H，et al.Transgenic alpha1A－adrenergic activation limits post－infarct ventricular remodeling and dysfunction and improves survival［J］.Cardiovasc Res，2006，71(4):735－743.

［13］Bernstein D，Jardo G，Zhao M.The role of β－adrenergic receptors in heart failure:differential regulation of cardiotoxicity and cardioprotection［J］. Prog Pediat Cardiol，2011，31(1):35－38.

［14］Mutlu G M，F(xiàn)actor P.Alveolar epithelial β2－adrenergic receptors［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2008，38:127－134.

［15］Matkovich S J，Diwan A，Klanke J L，et al.Cardiacspecific ablation of G－protein receptor kinase 2 redefines its roles in heart development andβ－adrenergic signaling［J］.Circ Res，2006，99(9):996－1003.

［16］李雷，高競(jìng)生.中國(guó)慢性心力衰竭的治療現(xiàn)況［J］.中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2011，14(7):1081－1084.

［17］慢性肺源性心臟病心力衰竭40例診治分析［J］.中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2010，13(2):238－239.