萬春飛，詹秀琴，孫玉明*

(1.南京中醫(yī)藥大學 第一臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，江蘇 南京 210029)

·實驗研究·

獨活寄生湯含藥血清對成骨細胞OPG/RANKL蛋白表達的影響

萬春飛1，詹秀琴2，孫玉明1*

(1.南京中醫(yī)藥大學 第一臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，江蘇 南京 210029)

目的:檢測獨活寄生湯含藥血清對成骨細胞OPG/RANKL蛋白表達的影響，從分子生物學層面探究獨活寄生湯治療骨質(zhì)疏松癥的機理，為獨活寄生湯治療骨質(zhì)疏松癥提供理論及實驗依據(jù)。方法：體外培養(yǎng)原代SD新生24 h大鼠成骨細胞，分別用生理鹽水血清對照組、獨活寄生湯含藥血清低濃度，中濃度，高濃度作用于成骨細胞,采用MTT法檢測獨活寄生湯含藥血清對成骨細胞生長的影響，Western Blot檢測獨活寄生湯含藥血清對成骨細胞OPG、RANKL蛋白表達的影響。結(jié)果：獨活寄生湯含藥血清以濃度及時間的依賴方式促進成骨細胞生長；Western Blot結(jié)果顯示不同濃度的獨活寄生湯含藥血清能促進成骨細胞OPG蛋白的表達，并且抑制成骨細胞RANKL蛋白的表達。結(jié)論：獨活寄生湯含藥血清可以通過OPG、RANKL系統(tǒng)促進成骨細胞的增殖并且影響成骨細胞的分化。

獨活寄生湯;成骨細胞;骨保護蛋白;核因子-κB受體活化子配體

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少，骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化為特征，以致骨的脆性增高而骨折危險性增加的一種全身性骨骼疾病[1]，該病發(fā)病率高，且容易合并嚴重并發(fā)癥[2-3]。近20年來，國內(nèi)廣泛開展了中醫(yī)中藥及中西醫(yī)結(jié)合防治骨質(zhì)疏松癥的研究，一些研究者探索了單味中藥和從單味中藥中提取的化學成分對治療骨質(zhì)疏松癥取得了一定的成果，其中，中藥葛根及其有效成分葛根素在治療骨質(zhì)疏松癥的方面取得了一定的成績。前期研究[4-5]表明給予原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者口服葛根素，每日30 g連續(xù)28 d，結(jié)果顯示骨質(zhì)疏松癥患者在VAS、活動能力、腰和背靜息痛等方面均較治療前有明顯的改善,且ALP、BGP、U-Ca/U-Cr、U-Hop/U-Cr等指標都有所下降，E2指標有所上升，其中BGP、U-Hop/U-Cr、U-Hop/U-Cr、E2等指標與每日口服αD30.5 μg對照有顯著性差異。獨活寄生湯源于中醫(yī)經(jīng)典名著《備急千金要方》，主要治療痹證日久、肝腎兩虛、氣血不足等證，現(xiàn)臨床多見于治療類風濕性關節(jié)炎[6]、強直性脊柱炎[7]、腰椎管狹窄癥[8]、腰椎間盤突出癥[9]、膝骨性關節(jié)炎[10]及產(chǎn)后身痛[11]等證，尚未見獨活寄生湯治療骨質(zhì)疏松癥方面文章，更未見其對骨質(zhì)疏松的作用機理研究的文章。獨活寄生湯方有補益肝腎、補脾健脾、活血養(yǎng)血、祛風除濕、蠲痹止痛的功效，其所主治之證與骨質(zhì)疏松癥的腎虛、脾虛、血瘀3個病機要素完全相對應[12]，在此理論下進行實驗研究，證明獨活寄生湯對由骨質(zhì)疏松癥引起的慢性腰、背疼痛有一定的治療效果。由此在臨床研究的基礎上探討獨活寄生湯對成骨細胞OPG/RANKL基因表達的影響，從分子生物學層面探索獨活寄生湯治療骨質(zhì)疏松癥的原理，為獨活寄生湯治療骨質(zhì)疏松癥提供可靠的理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 成骨細胞體外培養(yǎng) 通過酶消化法從新生24 h內(nèi)SD大鼠顱蓋骨分離提取成骨細胞。乳鼠10只75%乙醇中浸泡10 min；切下顱蓋骨置于D-Hanks液內(nèi);清除骨膜、血管以及結(jié)締組織，用D-Hanks液洗凈顱蓋骨，剪成1 mm×1 mm大小的骨片置于0.25%胰蛋白酶溶液中消化20 min；將消化后的顱蓋骨片移入0.1%Ⅱ型膠原酶溶液中振蕩40 min；將含細胞的消化液1 000 r/min離心10 min，吸去上清，細胞團塊用培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶，并放于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d換液1次直至90%細胞融合，常規(guī)消化細胞進行傳代。選擇第2代細胞用于實驗。[13]

1.2 含藥血清制備 取獨活寄生湯水煎液濃縮，藥物濃度分別相當于生藥含量為2.84、4.73、7.56 g/mL，大鼠給藥量為1 mL/100 g體質(zhì)量，1次/d,經(jīng)人-大鼠體表面積比值折算，相當于成人日用臨床劑量的3、5、8倍。取6月齡雌性SD大鼠(200±5)g，20只，隨機分為4組，分別灌服生理鹽水和低劑量、中劑量、高劑量獨活寄生湯濃縮制劑，給藥量為1 mL/100 g 體質(zhì)量，1次/d，連續(xù)5 d，末次給藥后1 h，乙醚麻醉，無菌條件下，腹主動脈取血，低溫放置1 h,2 500 r/min離心25 min分離血清，得到生理鹽水組血清(A)、獨活寄生湯含藥血清低劑量組(B)、中劑量組(C)及高劑量組(D)，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩14]

1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(GIBCO,USA)，消化劑為0.25%的胰蛋白酶(MERCK，USA)，噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)以及其他抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.4 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(SANYO,USA)，全自動酶標光度計，蛋白電泳槽，電轉(zhuǎn)移裝置(BIO-RAD，USA)，三洋超低溫冰箱(JAPAN)，TE300倒置相差顯微鏡(Nikon公司)，三用電熱恒溫箱(國營江蘇淮陰醫(yī)療器械廠)，隔熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器一廠)，電熱鼓風干燥箱(南京實驗儀器廠)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 成骨細胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，細胞單層鋪滿培養(yǎng)瓶后，用0.25%胰酶消化，2～3 min后，鏡下觀察細胞圓縮時，吸管吹打使細胞懸于液體中，加10%FBS培養(yǎng)液終止消化，加入適量培養(yǎng)液，分瓶培養(yǎng)。

2.2 噻唑藍還原法(MMT法)測定細胞生長促進率 在無菌條件下,取對數(shù)生長期的成骨細胞，用0.25%的胰酶消化,制成單細胞懸液。調(diào)整濃度，將細胞濃度調(diào)整為1×104/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加200 μL10%培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待成骨細胞貼壁后，棄上清液，每組設6個復孔,各孔加入DMEM 180 μL，實驗組中的生理鹽水血清組、獨活寄生湯含藥血清低劑量、中劑量、高劑量組加入不同濃度的藥物，每孔各加20 μL，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h，分別每孔加20 μL濃度為5 mg/mL的MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清液，各孔加150 μL的DMSO,輕度振蕩約10 min使其溶解，酶標儀于490 nm波長處測定吸光值(OD值)，計算在不同時間時，低劑量組、中劑量組、高劑量組對成骨細胞的促進率,重復3次。按公式計算細胞生長促進率(IR)=(獨活寄生湯含藥血清組平均OD值-空白血清組平均OD值)/空白血清組平均OD值×100%。

2.3 Western Blot檢測OPG/RANKL蛋白表達 將成骨細胞用0.25%的胰酶消化后，按照1×104/瓶的細胞密度接種于25 mL培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)細胞貼壁后,分別加入4 mLDMEM培養(yǎng)液,后加入獨活寄生湯低劑量、中劑量、高劑量溶液；對照組加入5 mL的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,提取各組細胞總蛋白,并用BCA法測定蛋白濃度,加熱變性后-20 ℃保存。取各組細胞的總蛋白70 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳,將分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF，用封閉液封閉濾膜4 h,按大約0.1 mL/cm2的量加入封閉液、適量一抗兔抗大鼠OPG(1∶500)、兔抗大鼠RANKL(1∶800)，兔抗大鼠β-actin(1∶5 000)。搖床振蕩培養(yǎng)(4 ℃，過夜)。PBST充分漂洗濾膜4次，每次10 min。將膜與HRP結(jié)合的二抗(辣根過氧化酶標記羊抗兔,二抗用封閉液稀釋)(1∶5 000)室溫下振蕩培養(yǎng)2 h，用PBST洗膜,充分漂洗4次，每次10 min。按照0.1 mL/cm2顯影液計算用量，將顯影液加于NC膜上，室溫放置1 min。用保鮮膜將膜包好，暗室中迅速將膜蛋白貼在X線膠片上曝光，洗片機中顯影、洗像。調(diào)整曝光時間,直到出現(xiàn)最佳條帶。

3 實驗結(jié)果

3.1 獨活寄生湯含藥血清促進成骨細胞的增殖 見表1。如表1所示,成骨細胞經(jīng)獨活寄生湯含藥血清作用后，細胞的生長呈現(xiàn)不同程度的增殖，并且呈時間、濃度依賴性的特點。

表1 獨活寄生湯含藥血清對成骨細胞生長的促進作用

注：與生理鹽水組相比，▲P<0.05。

3.2 獨活寄生湯含藥血清對成骨細胞OPG/RANKL相關蛋白表達的影響 成骨細胞經(jīng)過獨活寄生湯含藥血清低劑量、中劑量、高劑量作用24 h后，Western Blot分析表明，如圖1～3所示，與生理鹽水組血清相比，RANKL表達明顯降低，OPG表達明顯升高。

4 討論

目前在骨質(zhì)疏松癥的研究領域已進入到分子生物學的水平，尤其在基因復制、蛋白定量、信號通道等方面進行了深入廣泛地實驗研究。骨保護蛋白(Os-teoprotegerin，OPG)、核因子-κB受體活化子配體(receptor activator of NFKB ligand，RANKL)和核因子-κB受體活化因子(recetptor activator of NK-kb，RANK)是近年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子(TNF)家族中的幾個成員[15]，相關實驗研究表明通過調(diào)節(jié)OPG、RANKL、RANK的表達調(diào)控破骨細胞，從而調(diào)控骨吸收，成為骨吸收和骨重建的關鍵因素。其中OPG、RANKL都由成骨細胞、基質(zhì)細胞表達，是破骨細胞分化、調(diào)節(jié)的信號因子,與骨代謝相關幾乎所有重要的激素和細胞因子均可以通過調(diào)控OPG、RANKL的表達，從而達到調(diào)節(jié)骨重建的目的。

圖1 獨活寄生湯含藥血清對成骨細胞OPG/RANKL相關蛋白表達的影響

圖2 OPG/β-actin值

圖3 RANKL/β-actin值

研究表明RANK存在于破骨細胞前體細胞膜表面，是激活前體細胞和分化成破骨細胞最重要的信號通道，而由成骨細胞分泌的RANKL能激活該信號通道，直接刺激破骨細胞分化,并且與破骨細胞表面受體RANK結(jié)合，進而促進破骨細胞的形成、分化、成熟，并且能夠抑制破骨細胞的凋亡，延長破骨細胞存活時間,所以RANKL對于破骨細胞的分化是必需的[16]。本實驗研究Western blot結(jié)果顯示，與生理鹽水血清組相比，獨活寄生湯含藥血清組成骨細胞RANKL蛋白的表達顯著下調(diào),由此可以說明獨活寄生湯含藥血清可能通過抑制成骨細胞表達RANKL，抑制了破骨細胞的活性，進而達到治療骨質(zhì)疏松的目的。

OPG是一種由成骨細胞分泌的肝素結(jié)合分泌型糖蛋白，作為RANKL的可溶性誘餌受體，OPG對RANKL的競爭結(jié)合能力比RANK強，所以能通過與RANKL競爭性結(jié)合RANK，從而阻斷RANKL與破骨細胞表面的RANK結(jié)合，從而阻斷骨吸收信號的傳遞，抑制破骨細胞的分化和成熟，誘導破骨細胞的凋亡。實驗結(jié)果顯示，與生理鹽水血清組相比，獨活寄生湯含藥血清組成骨細胞OPG的表達明顯升高，由此可以說明獨活寄生湯含藥血清可能是通過促進成骨細胞表達OPG，增加與RANKL的結(jié)合，抑制破骨細胞的功能，而達到治療骨質(zhì)疏松的目的。

在本研究中,通過體外實驗觀察了獨活寄生湯對成骨細胞OPG/RANKL信號通路相關蛋白的表達的影響。研究結(jié)果表明，獨活寄生湯含藥血清具有促進成骨細胞生長的作用，促進成骨細胞OPG的表達，并且抑制RANKL基因的表達。可見，獨活寄生湯含藥血清可能是通過促進成骨細胞OPG的表達，抑制RANKL的表達，通過阻斷骨吸收信號的傳遞，阻止破骨細胞的激活、分化，抑制破骨細胞的活性，促進破骨細胞的凋亡，達到治療骨質(zhì)疏松癥的目的。

通過本次研究，根據(jù)獨活寄生湯含藥血清對成骨細胞OPG/RANKL基因表達的影響,筆者推測獨活寄生湯應該可以治療其他代謝性骨病及相關疾病，這也進一步拓展了獨活寄生湯的治療范疇。

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EffectofMedicatedSerumofDuhuojishengDecoction(獨活寄生湯)onthemRNAExpressionofOsteoprotegerinandReceptorActivatorofNF-κBLigand(RANKL)inOsteoblasts

WAN Chun-fei1,ZHAN Xiu-qin2,SUN Yu-ming1

(1.The First Clinical College,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,Jiangsu Province,China;2.The Pre-clinical Medicine college,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,Jiangsu Province,China)

ObjectiveTo investigate the effects of serum containing substances of a Chinese traditional drug,Duhuojisheng Decoction,on expression of osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of NF-κB ligand (RANKL)in osteoblasts,and to study the mechanism of action of Duhuojisheng Decoction treatment for osteoporosis.MethodsOsteoblasts were obtained from new born rat calvaria by collagenase-trypsin digestion.Four groups were included in the experiment and situ hybridization method was used to detect the expression of OPG and RANKL.ReaultsCompared with the normal serum group,the expression of OPG in osteoblasts in the serum of Duhuojisheng Decoction increased significantly,while the expression of RANKL decreased remarkably.ConclusionThe serum containing Duhuojisheng Decoction could not only inhibit the secretion of RANKL to repress the activity of osteoclast but also stimulate osteoblasts to secrete OPG,then the combination of OPG and RANKL increased,which could reduce the activity of RANKL and decresed the activity of the bone resorbing activity of obsteoclasts consequently.It may be one of the mechanism of actions of Duhuojisheng Decoction for treating osteoporosis.

DuhuojishengDecoction;Osteoblast;OPG;RANKL

R681.4

A

1003-5699(2013)01-0066-04

2012-09-05)

江蘇省老中醫(yī)藥專家學術(shù)經(jīng)驗繼承專項研究課題(序號：8)。

萬春飛(1985-)，男，碩士研究生。研究方向：骨質(zhì)疏松癥方向。

*通信作者：孫玉明，Tel：13813831688，E-mail:sunyumingliuxq@126.com。