文國容，金 海，徐尚福，楊 媛，計 蓓，周 姝，陳 萍，庹必光

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，貴州 遵義 563099; 2.遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室,貴州 遵義 563099；3.貴陽醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院 藥劑科，貴州 貴陽 550001)

小鼠原發(fā)性肝癌中胰島素樣生長因子2和H19的表達(dá)及意義

文國容1，金 海1，徐尚福2，楊 媛1，計 蓓1，周 姝1，陳 萍3，庹必光1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，貴州 遵義 563099; 2.遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室,貴州 遵義 563099；3.貴陽醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院 藥劑科，貴州 貴陽 550001)

目的觀察IGF2、H19在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)并了解其意義。方法建立原發(fā)性肝癌模型，模型建立后第20周處死小鼠取肝癌及癌旁組織儲存于-80 ℃?zhèn)溆?，另取正常小鼠肝臟作對照，用Real time RT-PCR方法檢測IGF2、H19 mRNA的變化。結(jié)果與對照組比較，IGF2、H19在癌旁及癌組織中的表達(dá)都顯著增加，在癌組織中增加更為顯著P<0.05。結(jié)論IGF2、H19的異常變化與小鼠原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

胰島素樣生長因子2；H19； 小鼠；原發(fā)性肝癌

近年來基因印跡和腫 瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系逐漸受到人們的關(guān)注，在某些病理情況下，處于印跡狀態(tài)的基因也可重新表達(dá)，引起一系列的病理生理改變。 印跡基因H19和胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor, IGF2 )是較早被發(fā)現(xiàn)的印跡基因，它們的基因印跡與原發(fā)性肝癌的關(guān)系怎樣，目前研究較少，我們希望通過檢測原發(fā)性肝癌中H19和 IGF2基因的印跡改變，了解印跡基因H19和IGF2與肝癌的關(guān)系，探討小鼠原發(fā)性肝癌中H19和IGF2的印跡調(diào)控，為肝癌的治療及預(yù)后提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器 二甲基亞硝胺(N-nitrosodiethylamine， DEN)(Sigma 公司)、四氯化碳(天津市協(xié)和吳鵬色譜科技有限公司)、胰島素樣生長因子2 和 H19及內(nèi)參β-actin引物(TaKaRa生物工程公司)、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RNA擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa生物工程公司)、實時熒光定量PCR儀(美國 BIO-RAD公司)、全波段酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

1.2 實驗動物 SPF級C57BL/6J雄鼠，4周齡，體重18～22 g，購自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心。動物許可證號：SCXK(渝)2012-0001。 自由飲水進(jìn)食，動物房室溫維持在23 ℃左右，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行肝癌造模。

1.3 肝癌模型制備及取材 模型制備參考文獻(xiàn)[1]，取30只小鼠，每只小鼠一次性腹腔注射DEN (100 mg/kg)，3 d后灌胃CCl4(橄欖油配制，濃度為20%)，0.05 mL 10 g，2次/周，14 d再次腹腔注射DEN (50 mg/kg)，同時開始每天給予含有9%乙醇的飲用水，第4周開始加大CCl4劑量至0.08 mL 10 g，直至造模結(jié)束。另取20只小鼠作為正常對照，不造模，僅自由飲用滅菌普通水。于20周后處死動物取癌組織、癌旁組織及正常肝組織儲存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 Real-Time RT-PCR檢測基因的表達(dá) 取50～100 mg的正常肝組織、癌旁組織、癌組織分別置于1 mL Trizol中勻漿，加入200 μL的氯仿，震蕩混勻，12 000 g/min，4 ℃離心15 min。吸取上清300 μL轉(zhuǎn)入另外去酶EP管中，加等量異丙醇混勻后，12 000 g/min，4 ℃離心10 min，棄去上清，在沉淀加入無RNA酶的75%乙醇洗滌兩次，每次12 000 g/min，4 ℃離心2 min,去上清液 ，待其干燥后加入50 μL DEPC水溶解RNA,用全波段酶標(biāo)儀檢測其純度和濃度。取200 ngRNA按試劑盒說明配成20 μL體系逆轉(zhuǎn)錄，然后按照擴(kuò)增試劑盒說明配制20 μL擴(kuò)增體系，PCR反應(yīng)條件為：第1步：95 ℃×5 min，第2步：95 ℃×30 s，60 ℃×1 min，循環(huán)40次，第3步：65 ℃×30 s，循環(huán)61次。目的基因的相對表達(dá)量以“目的基因/內(nèi)參基因”表示。引物序列(見表1)。

表1 Real-Time RT-PCR引物序列

Gene Forwardprimer ReverseprimerIGF-IIAGAGTTCAGAGAGGCCAAACGTTTGCTGGACATCTCCGAAGAGH19CCACCCACTCACTCAGGATTGGGCAGAAGAGAACTCACCTβ-actinTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA

2 結(jié)果

2.1 大體形態(tài)學(xué)觀察 正常肝臟顏色紅潤，表面光滑；肝癌模型組可見肝體積增大，表面有大小不等的結(jié)節(jié)(見圖1)。

注：A:正常肝臟;B:肝癌肝臟。 圖1 正常肝臟及肝癌肝臟大體圖片

2.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 正常肝組織中央靜脈清楚，細(xì)胞大小均勻，形態(tài)一致；肝癌組織則正常組織結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞大小不等，形態(tài)多樣，核大深染，核分裂像多見，并見病理性核分裂(見圖2)。

注：A:正常肝組織 (HE×200);B:肝癌組織(HE×200)。 圖2 正常肝組織及肝癌組織HE染色

2.3 RT-PCR檢測IGF2、H19 mRNA的表達(dá) 與正常對照組比較，IGF2在癌旁及癌組織中的表達(dá)均明顯上調(diào)，分別為正常組織的4.7倍和19倍(P<0.05)。H19癌旁組織中RNA的表達(dá)是正常組織的8.8倍，而癌組織是正常組織的32.8(P<0.05,見圖3、圖4)。

3 討論

基因印跡又稱基因組印跡或者配子印跡，H19、IGF2 印跡基因隸屬于同一個基因印跡群，分別位于人染色體11P15.5，鼠7 號染色體，在進(jìn)化上具有高度保守性[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，印跡異常是一些惡性腫瘤重要的分子生物學(xué)特征，也是發(fā)生癌變的重要因素之一。

Yoshimizu 等[3]用小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)H19 基因位點在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤的大小、數(shù)量等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，這也是首次有人提出H19基因在體內(nèi)具有抑制腫瘤作用， 但Matouk 等[4]則認(rèn)為 H19 是人源腫瘤生長所必需的， Ariel 等[5]認(rèn)為 H19 基因是人膀胱癌早期復(fù)發(fā)的一個標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，H19在小鼠正常組織中表達(dá)甚微，在癌旁組織及癌組織中均有表達(dá)，且在癌組織中高表達(dá)，但在癌組織中的表達(dá)是癌旁的四倍，該結(jié)果顯示，在肝癌組織中H19印跡上調(diào)，且在癌癥發(fā)生早期就發(fā)生改變，是否可作為其診斷的分子生物學(xué)標(biāo)志尚需更多的實驗結(jié)果加以證實。

基因組印跡是目前腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點，隨著分子生物學(xué)及表觀遺傳學(xué)的研究進(jìn)展，腫瘤與IGF2印跡基因的表達(dá)備受關(guān)注[6]。胰島素樣生長因子2(IGF2)是迄今所知功能最復(fù)雜的生長調(diào)控因子之一,它能促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂和分化并參與出生后基因組重建，所有的這些功能說明IGF2在機(jī)體生長發(fā)育過程中的重要性[7]，但其促進(jìn)有絲分裂過程是通過IGF2受體介導(dǎo)的，這是腫瘤細(xì)胞生長的一條重要通路，IGF2受體水平受阻可抑制腫瘤細(xì)胞生長。正常情況下，IGF2兩個等位基因中一個因為印跡而沉默，另一個正常表達(dá)，如果印跡的等位基因發(fā)生雜合性丟失(loss of heterozygosity，LOH)，導(dǎo)致雙等位基因表達(dá)，基因產(chǎn)物成倍增加，其過度表達(dá)參與了腫瘤的發(fā)生[8]。

原發(fā)性肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康，同其他腫瘤一樣，原發(fā)性肝癌的治療效果取決于能否早期發(fā)現(xiàn)，以及恰當(dāng)?shù)?、適合患者的“個體化”的治療方案。近年來，基因印跡與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系逐漸受到人們重視，有人相繼從卵巢癌、Wiim's瘤、骨肉瘤和大腸癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)IGF2和/ 或H19 的印跡異常[9-10]。我們的研究發(fā)現(xiàn)在小鼠原發(fā)性肝癌的癌旁組織中IGF2和H19表達(dá)開始增加，且癌組織增加更為顯著，說明兩者與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但I(xiàn)GF2和H19兩者的變化是否有關(guān)聯(lián)，調(diào)控機(jī)制與腫瘤發(fā)生，發(fā)展的關(guān)系怎樣，尚需要我們更深入的研究，希望能通過對小鼠原發(fā)性肝癌印跡基因IGF2和H19的研究，找到肝癌早期發(fā)生的標(biāo)志物，能為肝癌的預(yù)防及早期治療奠定新的理論及實驗基礎(chǔ)。

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EffectsofInsulin-likegrowthfactor2andH19inmousehepatocellularcarcinoma

Wenguorong1,Jinhai1,Xushangfu2,Yangyuan1,Jibei1,Zhoushu1,Chenping3,Tuobiguang1

(1.Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563099，China; 2. Department of Pharmacology of Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563099，China; 3. Department of Pharmacy，Tumor Hospital of Guiyang Medical College,Guizhou Guiyang 550001，China)

ObjectiveTo investigate the effects of IGF2 and H19 in mouse hepatocellular carcinoma and discuss its functional mechanism.MethodsC57BL/6J mice were given diethyl nitrosamine (DEN) and CCl4 to induce hepatocellular carcinoma. At 20 weeks, normal liver tissue, DEN-treated peri-cancerous and cancer tissue were collected to isolated total RNA. Expression of IGF2 and H19 were examined by real-time RT-PCR.ResultsCompared to the control，the levels of IGF2 and H19 in model group were significantly increased (P<0.05).ConclusionIncreased expression of IGF2 and H19 is associated with the development of DEN-induced hepatocellular carcinoma in mice.

IGF2；H19；mice；Hepatocellular Carcinoma

國家自然科學(xué)基金項目(NO:81160054)。

庹必光，男，博士，教授，研究方向：消化系統(tǒng)腫瘤及離子通道轉(zhuǎn)運，E-mail:tuobiguang@yahoo.com.cn。

R592

A

1000-2715(2013)05-0422-03

[收稿2013-07-23;修回2013-08-28]

(編輯：譚秀榮)