季 紅，高 青，胡先同，范英昌

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，天津 300193）

心肌梗死后心肌細(xì)胞損失并缺少內(nèi)生修復(fù)機(jī)制是導(dǎo)致心力衰竭的主要原因，通常認(rèn)為心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，成體心肌細(xì)胞本質(zhì)上不具有修復(fù)能力，因此損傷的心肌由纖維疤痕取代，繼而出現(xiàn)病理性心室重構(gòu)最終導(dǎo)致心室功能喪失，而干細(xì)胞移植通過取代梗死心肌細(xì)胞成為治療心肌梗死的最具前景的方法之一。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）由于其體外易于分離、擴(kuò)增，遺傳穩(wěn)定性，對多種重要組織有增強(qiáng)修復(fù)的潛能等優(yōu)點(diǎn)，可能成起目前細(xì)胞治療首選的干細(xì)胞模型。Friedenstei在1966年首次報(bào)道了MSCs的存在，并將其稱為骨形成前體細(xì)胞[1]。MSCs可在體外克隆擴(kuò)增超過100萬倍仍保留多向分體的能力[2-4]。MSCs僅占有核細(xì)胞的0.001%~0.01%，較造血干細(xì)胞少約10倍[5-6]。研究證明MSCs在體內(nèi)外均可分化為肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)抱、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞，并可在體外克隆擴(kuò)增超過100萬倍仍然保留多系分化能力[7-11]。

MSCs自我更新的調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多條信號通路控制著MSCs不同的分化方向和途徑,如絲裂素活化蛋白激酶（MAPK）[12-14]通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）超家族與Smad信號通路[15-16]、Wnt信號通路[17-19]等，近年來對 Wnt信號通路的研究逐漸成為熱點(diǎn)。

本研究在體外分離、擴(kuò)增MSCs，并用丹酚酸B誘導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞分化，通過檢測Wnt信號通路中關(guān)鍵物質(zhì)糖原合成激酶（GSK）-3β和βcatenin的濃度變化以闡明Wnt信號通路在MSCs向心肌細(xì)胞的分化中所起的作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量（200±20）g。（購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號：scxk2005-0001）。

1.2 主要試劑與儀器 丹酚酸B（Salvianolic acid B標(biāo)準(zhǔn)品，純度99%，Sigma公司）；L-DMEM培養(yǎng)液（Low glucose-Dulbecco’s-modified Eagle’s medium，美國GIBCO公司）；特級胎牛血清（FBS，以色列BioInd公司）；胰蛋白酶（1∶250，美國Hyclone公司）；乙二胺四乙酸（EDTA，天象人生物技術(shù)研究所）；青霉素、鏈霉素（美國 Hyclone公司）；D－Hanks緩沖液[氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鉀 （KH2PO4）、氫氧化鈉（NaOH）、碳酸氫鈉（NaHCO3），苯酚紅,南京化學(xué)試劑廠]；CD44兔多克隆抗體、CD34兔多克隆抗體（HCAM）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、心肌肌鈣蛋白 T（cTnT）、GSK、β-catenin引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，即用型SABC免疫組化染色試劑盒，DAB顯色試劑AR1025，均由武漢博士德生物工程有限公司提供；DNA/RNA/Protein Isolation Kit （OMEGA）。 TaqMan Reverse Transcription Reagents試劑盒（DRR014A，寶生生物公 司）、SYBR Green PCR MasterMix reagent kit（Applied Biosystems公司）。

2 方法

2.1 MSCs的分離培養(yǎng)、純化及鑒定 取雄性Wistar大鼠，頸椎脫臼處死，無菌條件下取雙側(cè)股骨、脛骨，適量D-Hank’s液沖洗骨髓，100目篩網(wǎng)過濾，以（0.1～2）×106個(gè)/L 的密度接種于完全培養(yǎng)液（L-DMEM含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素），置于37℃、5%二氧化碳（CO2）飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后首次換液，去除懸浮細(xì)胞，以后隔天更換一次培養(yǎng)液。造血細(xì)胞、纖維細(xì)胞和其他非貼壁細(xì)胞隨著換液被逐漸洗去，12～16 d后，細(xì)胞融合達(dá)80%～90%，用0.25%胰酶（含 0.01%EDTA）消化，1∶2～3傳代。反復(fù)傳到第3代，細(xì)胞得到純化，形成均一、同質(zhì)的細(xì)胞克隆。用鏈霉親和素—生物素—過氧化物酶復(fù)合物（SABC）法檢測細(xì)胞表面抗原CD44和CD34。

2.2 MSCs分組及誘導(dǎo) 將第3代的MSCs隨機(jī)分為4個(gè)誘導(dǎo)組，空白對照組（0組）、5－氮胞苷組（5-aza組）、丹酚酸B組（SalB組）、5－氮胞苷聯(lián)合丹酚酸B組（5-aza+SalB組）。誘導(dǎo)方法：對照組：MSCs僅在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；5-aza組：加入10 μmol/L的5-aza，37℃避光孵育 24 h后，換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液；SalB組：加入16 mg/L的SalB孵育24 h后，換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液；5-aza+SalB組：加入10 μmol/L 的 5-aza、16 mg/L 的SalB 孵育 24 h后，換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液；各組誘導(dǎo)4周。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定心肌特異性蛋白cTnT 將誘導(dǎo)4周的細(xì)胞，按即用型SABC免疫組化染色試劑盒說明進(jìn)行免疫組化染色，DAB顯色5～30 min，顯微鏡下觀察，每組隨機(jī)選取8張染色的細(xì)胞爬片，于400倍光鏡下每張爬片選5個(gè)不同的視野，數(shù)碼相機(jī)拍攝后，用Image Pro Plus6.0軟件檢測免疫細(xì)胞化學(xué)染色后的細(xì)胞陽性表達(dá)率（胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比）。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）檢測心肌特異性基因cTnT及Wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵物質(zhì)含量的表達(dá) 將各誘導(dǎo)組胰酶消化細(xì)胞，按照DNA/RNA/Protein Isolation Kit說明書,首先抽提總 RNA，取 2 μg總 RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件 25 ℃ 10 min；37 ℃ 120 min；85℃ 5 min；4℃，然后依照SYBR Green PCR MasterMix reagent kits說明書，以獲得的cDNA為模版，用PCR擴(kuò)增儀（ABI7500）進(jìn)行實(shí)時(shí)災(zāi)光定量核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)（QPCR），分別擴(kuò)增 GAPDH、心肌肌鈣蛋白（cTnT）、GSK-3β、β-catenin，反應(yīng)體系 25μL，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性15秒，退火/延伸60℃1min，共40個(gè)循環(huán)。所得CT值經(jīng)轉(zhuǎn)換后以2-ΔΔCT相對定量法獲得目的基因相對表達(dá)量數(shù)值。目的基因及內(nèi)參基因引物序列見表1。

表1 QPCR目的基因及內(nèi)參照基因引物序列Tab.1 Primer sequence of QPCR target gene and internal reference gene

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組計(jì)量資料比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間計(jì)量比較采用單因素方差分析，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各誘導(dǎo)組MSCs形態(tài)特征變化 倒置相差顯微鏡下，MSCs誘導(dǎo)前多呈紡錘形或長梭形，細(xì)胞形態(tài)較一致，呈“旋渦”樣生長。藥物誘導(dǎo)后各組細(xì)胞有大量死亡，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞形態(tài)逐漸開始變化，形態(tài)呈梭形，長方形、柱形的細(xì)胞數(shù)量相對增多，同時(shí)細(xì)胞增殖能力減弱，細(xì)胞數(shù)量較誘導(dǎo)前減少。個(gè)別胞漿中可見明顯顆粒狀物質(zhì)，部分視野可見肌絲樣結(jié)構(gòu)，而且細(xì)胞立體感強(qiáng)，折光性好。4周時(shí)細(xì)胞間發(fā)生融合，排列具有方向性，且更多視野可以觀察到明顯的肌絲樣結(jié)構(gòu)，見圖1-4。

3.2 大鼠MSCs的表型特征 SABC法檢測MSCs表面抗原CD44和CD34。結(jié)果顯示CD44呈陽性表達(dá)，CD34呈陰性表達(dá)。見圖5-6。

3.3 cTnT免疫組化結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，除SalB組外其余各誘導(dǎo)組cTnT均有一定程度的表達(dá)，各誘導(dǎo)組MSCs的cTnT免疫組化陽性表達(dá)率見表2。

圖1 MSCs原代培養(yǎng)4 d×100Fig.1 MSCs primary culture 4 d×100

圖2 MSCs原代培養(yǎng)12 d×100Fig.2 MSCs primary culture 12 d×100

圖3 MSCs誘導(dǎo)10 d 5-aza組×100倍Fig.3 MSCs induction 10 d 5-aza group×100

圖4 MSCs誘導(dǎo)10 d 5-aza+SalB組×100倍Fig.4 MSCs induction 10 d 5-aza+SalB group×100

圖5 MSCs CD44染色陽性×400Fig.5 MSCs CD44 staining positive×400

圖6 MSCs CD34染色呈陰性×400Fig.6 MSCs CD34 staining negative×400

表2 各誘導(dǎo)組MSCs的cTnT免疫組化陽性表達(dá)率（±s）Tab.2 cTnT immunohistochemistry positive expression rate of MSCs in each induction group（±s）%

表2 各誘導(dǎo)組MSCs的cTnT免疫組化陽性表達(dá)率（±s）Tab.2 cTnT immunohistochemistry positive expression rate of MSCs in each induction group（±s）%

注：兩組比較，P＜0.05。

組別 n 陽性表達(dá)率5-aza 8 22.42±9.975-aza+SalB 8 24.81±2.52

3.4 各誘導(dǎo)組cTnT及Wnt信號通路中關(guān)鍵物質(zhì)GSK-3β及β-catenin基因表達(dá)的改變 見表3。

表3 各組mRNA相對表達(dá)量的比較（±s）Tab.3 Comparison of mRNA relative transcript level in each group（±s）

表3 各組mRNA相對表達(dá)量的比較（±s）Tab.3 Comparison of mRNA relative transcript level in each group（±s）

注：5-aza組與各組兩兩比較，P<0.05。

組別 cTNT GSK-3β β-catenin 5-aza組 4.52±0.62* 2.09±0.34* 0.84±0.22*SalB 組 3.71±0.44* 3.61±0.41* 0.93±0.31*5-aza+SalB 組 4.15±0.56* 2.52±0.39* 0.78±0.19*

4 討論

MSCs是一種具有多種分化能力成體干細(xì)胞，由于其取材方便、易于體外培養(yǎng)擴(kuò)增，而且免疫原性也較低[20]，對組織損傷小。而成為基因治療、組織修復(fù)等方面的研究熱點(diǎn)，對MSCs的分離、純化、培養(yǎng)還沒有統(tǒng)一的方法，目前主要有4種方法即貼壁法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分離法和免疫磁珠法[21]，其中密度梯度離心法和貼壁法最為常用。研究證明，percoll分離得到的細(xì)胞較為均一，但多能分化性和增殖力不如貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，而MSC貼壁培養(yǎng)得到的細(xì)胞多能分化能力和增殖力好，缺點(diǎn)是純度不夠，但有研究表明擴(kuò)增二代后的細(xì)胞純度可達(dá)到98%，因此本實(shí)驗(yàn)中選取貼壁法對MSCs進(jìn)行分離。根據(jù)是利用細(xì)胞貼壁時(shí)間及貼壁牢固性的不同逐步通過換液去除造血細(xì)胞，通過傳代去除單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，取純度較高且增殖分化能力較強(qiáng)的第3代MSCs用作實(shí)驗(yàn)。

關(guān)于MSCs的分離和鑒定仍然沒有十分特異性的標(biāo)記，通常結(jié)合MSCS能夠自我更新、多向分化等干細(xì)胞特性以及排除造血干細(xì)胞標(biāo)記的方法進(jìn)行分選和鑒定，CD44是細(xì)胞黏附分子，是MSCs的重要標(biāo)志物，CD34分子是普遍認(rèn)同的造血干細(xì)胞的代表性標(biāo)志，MSCs高表達(dá)CD44，而不表達(dá)或弱表達(dá)CD34，本實(shí)驗(yàn)使用免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，觀察到細(xì)胞染色CD44陽性，CD34呈陰性，符合文獻(xiàn)報(bào)道。

cTnT作為心肌細(xì)胞內(nèi)的一種特異性結(jié)構(gòu)蛋白,參與組成細(xì)肌絲,并與心肌收縮和舒張的調(diào)節(jié)有關(guān)，cTnT僅在心肌細(xì)胞中表達(dá)，是鑒定心肌源性細(xì)胞的特異性標(biāo)志物[22]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測各組cTnT陽性表達(dá)率，發(fā)現(xiàn)SalB組未見心肌分化，其余組均有不同程度的心肌分化，而SalB+5-aza組陽性表達(dá)率明顯高于單獨(dú)使用5-aza組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR在檢測發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)4周后的各組MSCs表面cTnT表達(dá)明顯增加，而SalB+5-aza表達(dá)略高于5-aza，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步證明SalB協(xié)同5-aza可促進(jìn)向心肌分化?？梢哉J(rèn)定成功將MSCs誘導(dǎo)為心肌樣細(xì)胞。

Wnt/β-catenin信號通路是無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在整個(gè)進(jìn)化過程中有高度的保守性。在Wnt信號缺失時(shí)，GSK-3β與結(jié)腸腺癌樣息肉基因產(chǎn)物(APC)和軸蛋白(Axin)結(jié)合形成蛋白三體復(fù)合物，磷酸化βcatenin N基末端，使其被泛素化進(jìn)而通過蛋白酶體機(jī)制[23]被破壞。當(dāng)Wnt蛋白連接到Frizzled家族受體激活相關(guān)下游組件Dishevelled，可使GSK-3β失活，使β-catenin不斷累積，繼而進(jìn)入胞核與TCF/LEF相互作用，引起靶基因的轉(zhuǎn)錄。調(diào)控與細(xì)胞周期有關(guān)的一系列基因的表達(dá)，因此在胞內(nèi)的表達(dá)水平被認(rèn)為與細(xì)胞的增殖和遷移密切相關(guān)[24-25]。

研究證明Wnt信號系統(tǒng)在調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、形態(tài)、增殖、遷移及結(jié)構(gòu)修復(fù)均起著重要的作用[26-28]。一般認(rèn)為Wnt信號可以通過非經(jīng)典通路促進(jìn)BMSCs向心肌細(xì)胞分化[29-30]，近年來的研究表明，經(jīng)典Wnt信號通路在心肌形成初期被激活，并在心肌分化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Zelarayan L等發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin通路在間充質(zhì)細(xì)胞向心肌分化早期被激活，然而心肌細(xì)胞后期的分化卻需要下調(diào)βcatenin[31]。TeruyaNakamura等也發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路在P19CL6細(xì)胞向心肌分化早期中被激活[32]。因此有人提出，Wnt經(jīng)典信號傳導(dǎo)對心臟的形成和分化也不是單一的抑制作用，而是表現(xiàn)為雙向作用，早期為促進(jìn)作用,晚期為抑制作用。筆者將誘導(dǎo)4周后的MSCs，用RT-PCR方法檢測了Wnt信號通路中兩個(gè)關(guān)鍵信號分子GSK-3β和β-catenin的表達(dá)，結(jié)果顯示MSCs誘導(dǎo)后，GSK-3β表達(dá)上調(diào)，β-catenin的表達(dá)有所下調(diào)，說明在其向心肌細(xì)胞分化后期中經(jīng)典的信號通路受到抑制。本研究的結(jié)果進(jìn)一步論證了這種說法。

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