溫度對(duì)相同引種地三個(gè)秋茄居群遺傳多樣性的影響

楊 娟，馬小偉，章宏瓊，周 云，宋佳楠，朱憶思?jí)?，張洪勤，施孟?/p>

(1. 杭州師范大學(xué)發(fā)育與再生研究所，浙江 杭州 310036;2. 溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟(jì)學(xué)院，浙江 溫州 325035;3. 溫州醫(yī)科大學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，浙江 溫州 325035)

溫度對(duì)相同引種地三個(gè)秋茄居群遺傳多樣性的影響

楊 娟1，馬小偉2，章宏瓊2，周 云2，宋佳楠2，朱憶思?jí)?，張洪勤2，施孟如3

(1. 杭州師范大學(xué)發(fā)育與再生研究所，浙江 杭州 310036;2. 溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟(jì)學(xué)院，浙江 溫州 325035;3. 溫州醫(yī)科大學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，浙江 溫州 325035)

秋茄是世界分布最北的紅樹(shù)植物，研究溫度對(duì)其遺傳多樣性的影響有助于闡明其抗凍機(jī)制.文章同時(shí)應(yīng)用RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)3個(gè)不同緯度地區(qū)秋茄居群的遺傳多樣性和遺傳分化進(jìn)行分析，根據(jù)RAPD 和 ISSR 數(shù)據(jù)計(jì)算遺傳距離并進(jìn)行聚類分析.2種方法均顯示3個(gè)居群分為2大支：西門(mén)島和象山港兩居群之間遺傳距離最小，兩者之間的遺傳一致度最大，首先聚為一類；漳江口和象山港居群之間的遺傳距離最大，兩者之間的遺傳一致度最小，因此單獨(dú)為一支.由于溫度的原因?qū)σN的秋茄進(jìn)行了篩選，導(dǎo)致遺傳多樣性減少.

秋茄；RAPD；ISSR；遺傳多樣性

紅樹(shù)林是處于亞熱帶、熱帶海洋與陸地過(guò)渡帶的特殊生態(tài)系統(tǒng)，是海岸帶的生態(tài)關(guān)鍵區(qū)，具有抵抗海嘯和臺(tái)風(fēng)、調(diào)節(jié)區(qū)域氣候、維護(hù)生物多樣性等重要生態(tài)功能[1].秋茄(Kandeliacandel)是中國(guó)分布最廣的常見(jiàn)紅樹(shù)植物，其天然分布最北至福建福鼎市，人工種植最北至寧波象山港，全世界最北分布的紅樹(shù)植物也是秋茄[2].國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)秋茄在生態(tài)學(xué)[3-4]、生理學(xué)[5-6]、生物化學(xué)[7]、藥物學(xué)[8]、耐鹽機(jī)理[9]、分子[10]等多個(gè)方面開(kāi)展了大量研究.林盛昌等[11]采用月最低溫度這一指標(biāo)，以溫差2 ℃ 劃分，并結(jié)合野外考察資料，把中國(guó)紅樹(shù)植物分為7個(gè)耐寒等級(jí)序列，其中秋茄自然分布緯度最高，具有極強(qiáng)的適應(yīng)能力，為最耐寒的種類.但向高緯度移植時(shí)經(jīng)常發(fā)生的極端低溫對(duì)其成功越冬產(chǎn)生了威脅[12].對(duì)此，各有關(guān)國(guó)家開(kāi)展了各方面研究，但大多集中在生物化學(xué)、生態(tài)學(xué)、生理學(xué)[13]等領(lǐng)域, 而關(guān)于分子生物學(xué)的研究也十分必要.

本研究選擇秋茄作為研究對(duì)象，采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 (Randomly amplified polymorphism DNA,RAPD)和簡(jiǎn)單序列重復(fù)間區(qū)(inter-simple sequence repeat,ISSR)分子標(biāo)記技術(shù)，探討溫度對(duì)來(lái)源于同一地區(qū)3個(gè)秋茄居群的遺傳多樣性和遺傳分化的影響,為高緯度選育抗凍秋茄品種提供技術(shù)理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與處理

秋茄葉片采自廈門(mén)漳江口、溫州西門(mén)島和寧波象山港(表1).在選定的3個(gè)不同緯度居群中每隔 5～10 m選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的植株，每樹(shù)采集當(dāng)年生的展開(kāi)完全的幼嫩葉片(倒二葉)10片，用棉花蘸取足夠的水分包住莖枝條的基部，保持葉片新鮮不變質(zhì)，迅速放冰上保存，處理待測(cè)，并于-20 ℃冰箱內(nèi)保存.

表1 取樣地基本情況Tab. 1 Basic information of sample area

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

NANODROP 2000為T(mén)hormal公司產(chǎn)品；Gel Doc電泳凝膠成像系統(tǒng)，DTC200PCR儀均為Bio-Rad公司產(chǎn)品；UV 2800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)為上海尤尼柯公司產(chǎn)品；5417R低溫離心機(jī)為Eppendorf產(chǎn)品.

ISSR引物、RAPD引物、1 Kbp DNA Ladder Marker購(gòu)自上海捷瑞生物公司，Taq酶購(gòu)自大連寶生物.

1.3 方法

秋茄葉片總DNA采用改良后的CTAB法[14]提取，獲得的DNA 由NANODROP 2000測(cè)定其濃度及純度.根據(jù)基因組 DNA 濃度值將樣品稀釋至20 ng/μL 用于RAPD和ISSR分析.

表2 RAPD和ISSR引物序列和最佳退火溫度Tab. 2 Primers and annealing temperature screened for RAPD and ISSRamplification

RAPD-PCR反應(yīng)對(duì)15個(gè)RAPD引物進(jìn)行篩選，從中選取8個(gè)擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性穩(wěn)定的引物用于RAPD-PCR的擴(kuò)增(表2).擴(kuò)增體系為每25 μL反應(yīng)體積含：2.5 μL 10×PCR Buffer(Mg2+free)、2.0 μL dNTP mixture(2.5 mmol/L)、1.5 μL MgCl2(25 mmol/L)、2.0 μL prime(10 μmol/L)，1.0 μL DNA(30～50 ng)，1.5 μL TaKaRa Taq(5 U/μL)，加ddH2O至25 μL，用漩渦混合器對(duì)所加的各組分進(jìn)行混合；擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，之后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性1 min、36 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，最后于72 ℃再延伸7 min.將擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定.

ISSR-PCR反應(yīng)對(duì)15個(gè)ISSR引物進(jìn)行了篩選，從中選取9個(gè)擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性較好的引物用于PCR擴(kuò)增(表2).擴(kuò)增體系為每25 μL反應(yīng)體積含：2.5 μL 10×PCR Buffer(Mg2+free)、2.0 μL dNTP mixture(2.5 mmol/L)、1.5 μL MgCl2(25 mmol/L)、2.0 μL prime(10 μmol/L)，1.0 μL DNA(30～50 ng)，1 U TaKaRa Taq(5 U/μL)，加ddH2O至25 μL；擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，之后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性45 s、52 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，最后于72 ℃再延伸7 min.將擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定.

重復(fù)擴(kuò)增和電泳2次，選取清晰的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.電泳圖譜的每條帶DNA片段均為1個(gè)分子標(biāo)記代表1個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)分子標(biāo)記的遷移率及有無(wú)來(lái)統(tǒng)計(jì)所有的二元數(shù)據(jù).有帶顯性記為“1”， 無(wú)帶隱性記為“0”. PopGen32軟件計(jì)算各數(shù)據(jù)，并根據(jù)Nei’s遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù).

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同緯度秋茄居群的遺傳多樣性

2.1.1 RAPD實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析

Marker：100 bp Plus DNA Ladder；泳道1～8：象山港居群8株不同秋茄樣品；泳道9～16：西門(mén)島居群8株不同秋茄樣品；泳道17～24：漳江口居群8株不同秋茄樣品.圖1 RAPD引物S58的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 RAPD-PCR results of primer S58

用篩選出的8個(gè)RAPD隨機(jī)引物在3個(gè)緯度秋茄居群24個(gè)個(gè)體間擴(kuò)增，得到的條帶為0.3 ～3 kb.共擴(kuò)增出1 152個(gè)條帶，多態(tài)性條帶為 30條，圖1為引物S58的擴(kuò)增結(jié)果.根據(jù)RAPD擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算，3個(gè)居群的多態(tài)位點(diǎn)百分率在17.46%～53.97%，平均值為39.15%(表3).每個(gè)位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)為1.346 1±0.460 0.Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)是衡量群體遺傳多樣性的指標(biāo).3個(gè)居群的H指數(shù)為0.075 8 ～ 0.226 5，總基因多樣度(Ht)和居群內(nèi)基因多樣度(Hs)分別為0.255 6和0.166 8.計(jì)算基因分化系數(shù)(Gst)為0.347 4，其中居群間的遺傳變異占總的遺傳變異的34.74%，居群內(nèi)的遺傳變異占總變異的65.26%，表明居群內(nèi)存在較高的遺傳分化.3個(gè)居群之間的基因流(Nm)為1.276 6，表明溫秋茄居群間的基因交流較高.3個(gè)居群的Shannon’s信息指數(shù)(I)為0.108 7～0.327 6，平均值為0.290 9，居群間的I指數(shù)為0.328 1(表3).3個(gè)居群中，漳江口居群表現(xiàn)出相對(duì)較高的遺傳多樣性，象山港居群和西門(mén)島居群表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性.

表3 RAPD標(biāo)記的秋茄3個(gè)居群的遺傳多樣性Tab. 3 Genetic variations in three populations of Kandelia candel by RAPD

2.1.2 ISSR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析

Marker：100 bp Plus DNA Ladder；泳道1～8：象山港居群8株不同秋茄樣品；泳道9～16：西門(mén)島居群8株不同秋茄樣品；泳道17～24：漳江口居群8株不同秋茄樣品.圖2 ISSR引物BW09481HAP的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 ISSR-PCR results of primer BW09481HAP

9個(gè)ISSR隨機(jī)引物擴(kuò)增3個(gè)秋茄居群共24個(gè)個(gè)體.擴(kuò)增的條帶為0.15～2.2 kb，共擴(kuò)增出1 368個(gè)條帶，多態(tài)性條帶為22條.圖2為引物BW09481HAP擴(kuò)增結(jié)果.3個(gè)居群的多態(tài)位點(diǎn)百分率為29.82%～54.39%，平均值為41.52%(表4).每個(gè)位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)為1.415 2±0.444 4.本實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)居群的H指數(shù)為0.096 2～0.245 3，總基因多樣度和居群內(nèi)基因多樣度分別為0.230 0和0.171 7.基因分化系數(shù)為0.253 5，其中居群間的遺傳變異占總遺傳變異的25.35%，居群內(nèi)的遺傳變異占總變異的74.65%，表明居群內(nèi)存在較高的遺傳分化.3個(gè)居群之間的基因流為1.622 8，表明溫秋茄居群間的基因交流較高.3個(gè)居群的I指數(shù)為0.145 0～0.347 4，平均值為0.247 2，居群間的I指數(shù)為0.349 5.3個(gè)居群中，漳江口居群表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，象山港居群和西門(mén)島居群表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性，此結(jié)果與RAPD實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.

表4 ISSR標(biāo)記的秋茄3個(gè)居群的遺傳多樣性Tab. 4 Genetic variation in three populations of Kandelia candel by ISSR

2.2 遺傳相似性分析

表5 RAPD標(biāo)記的秋茄居群間的Nei’s無(wú)偏差遺傳距離(對(duì)角線以下)及遺傳相似系數(shù)(對(duì)角線以上)Tab. 5 Nei’s genetic distance(below diagonal) and geneticidentity(above diagonal) by RAPD

遺傳分化指數(shù)只能對(duì)居群分化的程度作出評(píng)價(jià)，卻不能判定居群間相互關(guān)系的遠(yuǎn)近，而遺傳相似系數(shù)和遺傳距離的度量則可以說(shuō)明每個(gè)居群間彼此關(guān)系的遠(yuǎn)近.用popgene32軟件分析RAPD與ISSR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算秋茄居群間的Nei’s無(wú)偏差遺傳距離(D)和遺傳一致度.

圖3 RAPD標(biāo)記的秋茄居群間Nei’s無(wú)偏差的UPGMA 聚類圖Fig. 3 Nei’s Unbiased Measures of Biosystematic dengrogram of Kandelia candel populations by RAPD

表5為根據(jù)RAPD結(jié)果計(jì)算所得秋茄居群間的Nei’s無(wú)偏差遺傳距離(D)和遺傳一致度.結(jié)果顯示：3個(gè)秋茄居群間的Nei’s無(wú)偏差遺傳距離在0.014 6～0.140 8；其中西門(mén)島和象山港兩居群之間遺傳距離最小(0.014 6)，兩者之間的遺傳一致度最大(0.985 5)；漳江口和西門(mén)島之間的遺傳距離最大(0.140 8 )，兩者之間的遺傳一致度最小(0.868 6).依據(jù)Nei’s的遺傳距離對(duì)不同居群進(jìn)行UPGMA 聚類，分析結(jié)果(圖3)表明：3個(gè)居群分為2大支，象山港與西門(mén)島兩個(gè)居群的遺傳距離最小，首先聚為一類；漳江口居群與其它居群遺傳距離最遠(yuǎn)，單獨(dú)為一支.

ISSR結(jié)果用popgene32軟件計(jì)算秋茄居群間的Nei’s無(wú)偏差遺傳距離(D)和遺傳一致度.由表6結(jié)果可知： 3個(gè)秋茄居群間的Nei’s無(wú)偏差遺傳距離在0.069 3～0.137 3；其中西門(mén)島和象山港兩居群之間遺傳距離最小(0.069 3)，兩者之間的遺傳一致度最大(0.933 1)；漳江口和象山港之間的遺傳距離最大(0.137 3)，兩者之間的遺傳一致度最小(0.871 7).依據(jù)Nei’s的遺傳距離對(duì)不同居群進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)果表明：3個(gè)居群分為2大支，象山港與西門(mén)島兩個(gè)居群的遺傳距離最小，首先聚為一類；漳江口居群與其它居群遺傳距離最遠(yuǎn)，單獨(dú)為一支(圖4).

表6 ISSR標(biāo)記的秋茄居群間的Nei’s無(wú)偏差遺傳距離(對(duì)角線以下)及遺傳相似系數(shù)(對(duì)角線以上)

圖4 ISSR標(biāo)記的不同緯度秋茄居群間Nei’s無(wú)偏差的UPGMA 聚類圖Fig. 4 Nei’s Unbiased Measures of Biosystematic dengrogram of Kandelia candel populations by ISSR

3 討 論

遺傳多樣性的產(chǎn)生是由于遺傳信息在外界或內(nèi)在因素作用下，在復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)差錯(cuò)(如DNA片段的缺失、倒位、轉(zhuǎn)座或易位等)，從而導(dǎo)致了各種不同的遺傳變異.植物居群遺傳變異的分布與該物種的地理分布情形、 生態(tài)特征有關(guān)[15]，植物群體遺傳多樣性水平表明了一個(gè)物種在特定環(huán)境中基因的豐富程度，是物種適應(yīng)環(huán)境和遺傳進(jìn)化的基礎(chǔ).

物種的遺傳多樣性水平可以為其現(xiàn)狀和保護(hù)價(jià)值的評(píng)估以及遷地保護(hù)提供非常重要的信息.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3個(gè)居群內(nèi)存在較高的遺傳分化.而居群的遺傳結(jié)構(gòu)從一定意義上說(shuō)是基因流和遺傳漂變兩種力量相互作用的結(jié)果.居群間存在的基因流的強(qiáng)弱對(duì)群體遺傳分化具有重要影響，當(dāng)Nm>1時(shí)，基因流能發(fā)揮其均質(zhì)化作用，可防止由遺傳漂變引起的居群間的遺傳分化；如果Nm<1，基因流成為遺傳分化的主要原因，低水平的基因流可能造成群體對(duì)局部生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)，進(jìn)而促使群體間的遺傳隔離，導(dǎo)致種群間明顯的遺傳分化.植物居群間的基因流是借助于花粉、種子、孢子、植株個(gè)體以及其他攜帶遺傳物質(zhì)的物體為媒介進(jìn)行的，其中花粉和種子擴(kuò)散是自然植物種群最主要的基因流.而地理隔離是阻止花粉和種子擴(kuò)散等基因流的最主要因素.本研究中居群間的Nm均遠(yuǎn)大于1，可能是不同居群地理間隔不大，尤其是西門(mén)島居群與象山港居群從漳江口居群引種，所以不同居群間發(fā)生基因交流的頻率較高.加上本實(shí)驗(yàn)采樣地的限制，從而造成種群間的分異不明顯.

多態(tài)位點(diǎn)百分率可以作為遺傳多樣性高低的指標(biāo)[16].本研究RAPD和ISSR分析結(jié)果均顯示, 3個(gè)居群的多態(tài)位點(diǎn)百分率依次為漳江口居群>西門(mén)島居群>象山港居群，表明3個(gè)居群中，漳江口居群具有較高的遺傳多樣度.秋茄基因組的多樣性是其廣泛適應(yīng)性的決定因素，許多研究表明，低溫是限制紅樹(shù)植物向高緯度分布的重要因子[17]，秋茄在高緯度引種過(guò)程中，主要的環(huán)境制約因子是溫度，特別是最低月均溫.而本研究所采用的西門(mén)島及象山港秋茄樣品均由漳江口引種，由于三地緯度及平均溫度等自然環(huán)境條件差異較大，其居群經(jīng)自然選擇，不適應(yīng)低溫秋茄植株被淘汰，而適應(yīng)低溫的秋茄保留下來(lái)并產(chǎn)生了相應(yīng)的適應(yīng)性.聚類分析結(jié)果表明：3個(gè)居群分為2大支，西門(mén)島和象山港兩居群首先聚為一類；漳江口居群?jiǎn)为?dú)為一支.實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合3個(gè)秋茄居群的地理分布.

本研究結(jié)果表明，向更高緯度地區(qū)引種紅樹(shù)植物時(shí)可選擇與抗凍秋茄遺傳關(guān)系和生理特性接近的樹(shù)種.由于溫度的影響，同地引種的秋茄在遺傳多樣性上已經(jīng)發(fā)生了一定的變化，生產(chǎn)在溫度較低地方的秋茄居群遺傳多樣性更小，但同時(shí)為低緯度引種篩選出有著優(yōu)良遺傳基因的品種.

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TheEffectsofTemperatureontheGeneticDiversityofThreeKandeliaCandelPopulationsinSympatricIntroducingSite

YANG Juan1, MA Xiaowei2, ZHANG Hongqiong2, ZHOU Yun2, SONG Jianan2,ZHU Yisimeng2, ZHANG Hongqin2, SHI Mengru3

(1.Insitute of Developmental and Regenerative Biology, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China; 2.Renji College,Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China;3.Experimental Teaching Center of Biology, Wenzhou Medical University,Wenzhou 325035, China)

Kandeliacandelis the northernmost distribution of mangrove in the world. The study about the effects of temperature on the genetic diversity of threeKandeliacandelpopulations in sympatric introducing site is useful to clarify the antifreeze mechanism. RAPD and ISSR molecular markers were used to detect the genetic diversity and genetic differentiation of threeKandeliacandelpopulations in three different latitudes, and the genetic distances were calculated and clustering analyzed with the data of RAPD and ISSR. Both of the two methods showed that these three populations were separated to two groups. Ximen Island and Xiangshangang populations were clustered into one group, because the smallest genetic distance and the maximum genetic identity were found between them. Zhangjiangkou population was clustered into a group, because the largest genetic distance and the minimum genetic identity were found between Zhangjiangkou and Xiangshangang populations. The reason why the genetic diversity drops off is that the fall of temperature.

Kandeliacandel; Randomly amplified polymorphism DNA; inter-simple sequence repeat; genetic diversity

2013-05-22

施孟如(1979—)，女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事蛋白質(zhì)組學(xué)和分子生物學(xué)研究.E-mail：dreamlike007@163.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2013.06.013

Q948

A

1674-232X(2013)06-0544-06