磁性納米顆粒作為載體在基因轉(zhuǎn)染中的研究進(jìn)展

盧艷敏

衡水學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 衡水 053000

在進(jìn)行基因治療及基因功能研究時(shí)，外源基因能否有效地導(dǎo)入受體細(xì)胞，并進(jìn)行高效、穩(wěn)定的表達(dá)，在很大程度上取決于所采用的載體。理想的基因載體應(yīng)該制備簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，轉(zhuǎn)染效率高，具有良好的靶向性、較高的安全性，無(wú)免疫原性，能將目的基因整合至受體細(xì)胞的染色體上，實(shí)現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定表達(dá)。傳統(tǒng)的基因傳遞系統(tǒng)分為病毒載體介導(dǎo)系統(tǒng)和非病毒載體介導(dǎo)系統(tǒng)[1-2]。病毒載體主要包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體[3]、腺病毒載體[4]、腺相關(guān)病毒載體、慢病毒載體[5-7]、單純皰疹病毒載體[8-9]。病毒載體是基因治療中較為常用的DNA運(yùn)載工具[10]，其運(yùn)載效率高達(dá)90%以上，但該系統(tǒng)具有免疫原性和病毒性，裝載容量有限，組裝難度大，花費(fèi)高，因此限制了病毒載體的廣泛使用。非病毒載體主要包括脂質(zhì)體[11]、陽(yáng)離子多聚體[11-16]和納米顆粒[10,17-18]。磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNP）具有很強(qiáng)的結(jié)合、濃縮與保護(hù)DNA的作用，較高的安全性和低的免疫原性；具有超順磁性，在外加磁場(chǎng)的作用下可實(shí)現(xiàn)基因的靶向性運(yùn)輸，提高外源基因的轉(zhuǎn)染效率。在磁性納米顆粒表面修飾生物材料，可以提高磁性納米顆粒的生物相容性。磁性納米顆粒有望在寄主范圍、基因裝載容量、轉(zhuǎn)染效率等方面克服現(xiàn)有基因載體的局限性，是一種極具應(yīng)用前景的非病毒載體。由于磁性納米顆粒的獨(dú)特性質(zhì)，使得其作為基因載體在基因治療中的應(yīng)用得到迅速發(fā)展。

1 磁性納米顆粒的特點(diǎn)、種類(lèi)及結(jié)構(gòu)

磁性納米顆粒因其處于納米級(jí)，除了具有其他納米材料的特性外，還具有特殊的磁性能力即超順磁性。當(dāng)具有磁性的顆粒小于某一臨界值時(shí)，外場(chǎng)產(chǎn)生的磁取向力太小而不足以抵抗熱騷動(dòng)的干擾，導(dǎo)致其磁化性質(zhì)與順磁體相似，稱(chēng)作超順磁性。當(dāng)有外加磁場(chǎng)存在時(shí)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的磁性，當(dāng)撤去外加磁場(chǎng)時(shí)磁性隨之消失，不會(huì)產(chǎn)生剩磁。

磁性納米顆粒一般為核-殼式結(jié)構(gòu)，由磁性材料和提供活性功能基團(tuán)的材料組成。磁性材料主要是納米級(jí)的鐵、鎳、鈷等金屬及其氧化物，其中應(yīng)用最多的是Fe3O4。提供活性功能基團(tuán)的材料包括天然生物大分子材料和合成的高分子材料兩大類(lèi)[19]，天然生物大分子材料主要有葡聚糖、淀粉、蛋白質(zhì)等；合成的高分子材料主要有聚乙二醇、聚乙烯醇、聚N-異丙基丙烯酰胺及其共聚物，要求其具有良好的生物兼容性，無(wú)毒性，并具備一定的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性。磁性納米顆粒一般有3種包裹方式：核-殼結(jié)構(gòu)，核為金屬氧化物，殼層為高分子材料；殼-核結(jié)構(gòu)，核為高分子材料，磁性納米材料包裹到外面；殼-核-殼結(jié)構(gòu)，外層和內(nèi)層均為高分子材料，磁性納米材料位于2層高分子材料中間。磁性納米顆粒的制備方法有多種，可分為物理法和化學(xué)法，主要有共沉淀法[20]、水熱法[21]、微乳液法[22]、溶膠-凝膠法[23]、模板法[24]等，每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)需求選擇適當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>

2 磁性納米基因載體的特點(diǎn)

作為基因載體的磁性納米顆粒是由含有磁性或可以被磁化的金屬如鐵、鈷、鎳及其金屬氧化物等材料制備而成的，通過(guò)共聚、表面改性等賦予其表面多種功能基團(tuán)（如-OH、-COOH、-CHO、-NH2等），便于偶聯(lián)DNA等遺傳物質(zhì)形成磁性納米顆粒/DNA復(fù)合物，在外加磁場(chǎng)驅(qū)動(dòng)作用下將攜帶基因的磁性納米顆粒定位富集于細(xì)胞表面或定向輸送到靶部位，增加了磁性納米顆粒/基因復(fù)合物與靶部位的接觸時(shí)間和接觸量，提高了基因載體的靶向性和基因轉(zhuǎn)染效率[25-26]。磁性納米顆粒介導(dǎo)的體外基因傳遞是將磁性納米顆粒/DNA復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)，在細(xì)胞培養(yǎng)物的下面放置磁鐵，加速了攜帶基因的磁性納米顆粒的沉降，提高了轉(zhuǎn)染速度和效率[27]。磁性納米顆粒/基因復(fù)合物在外加磁場(chǎng)作用下首先吸附到細(xì)胞表面，隨后進(jìn)入細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染1～2 h后形成核周環(huán)復(fù)合物，其后數(shù)小時(shí)被轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi)。Sauer等將磁性納米顆粒/基因復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)分為3個(gè)時(shí)期：第一時(shí)期，復(fù)合物向細(xì)胞膜移動(dòng)，隨后進(jìn)入細(xì)胞，此過(guò)程為肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)；第二時(shí)期，復(fù)合物被運(yùn)送到細(xì)胞的限制組件中；第三時(shí)期，復(fù)合物通過(guò)微管被運(yùn)送到細(xì)胞核內(nèi)[28]。磁性納米顆?？梢越閷?dǎo)體內(nèi)基因的傳遞，攜帶治療基因的磁性納米顆粒通過(guò)靜脈注射入體內(nèi)，將磁鐵置于靶部位，在外加磁場(chǎng)的作用下，磁性納米顆粒攜帶的基因通過(guò)血管進(jìn)入靶組織，發(fā)揮治療功能[29]。

目前磁性納米顆粒中作為基因載體應(yīng)用較多的是氧化鐵磁性納米顆粒，磁性氧化鐵納米顆粒的制作工藝簡(jiǎn)單，粒徑容易控制，具有比表面積效應(yīng)，易于結(jié)合DNA，具有超順磁性，在外加磁場(chǎng)的作用下具有較強(qiáng)的磁性，可以實(shí)現(xiàn)靶向性運(yùn)輸，撤去磁場(chǎng)則磁性很快消失，不會(huì)被永久磁化。氧化鐵對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，不易被酶消化降解，在磁性氧化鐵的表面可很容易地包埋生物高分子，使其具有很高的生物相容性，同時(shí)便于與外源基因結(jié)合。

研究發(fā)現(xiàn)，氧化鐵納米顆粒在酸性條件下Zeta電位為正，可以與DNA結(jié)合；而在中性和堿性條件下Zeta電位為中性或負(fù)性，不利于DNA的結(jié)合，不能滿足生理pH條件下的基因轉(zhuǎn)移。因此，為了提高DNA的裝載量，使用帶正電荷的高分子材料對(duì)氧化鐵進(jìn)行表面修飾[30]。唐秋莎等采用化學(xué)共沉淀法制備了磁性納米顆粒，然后用聚乙烯亞胺（PEI）對(duì)合成的納米顆粒進(jìn)行表面修飾，發(fā)現(xiàn)PEI修飾的磁性納米粒子能與DNA結(jié)合，并可有效地保護(hù)DNA免受DNaseⅠ的消化[31]。譚澤明以偶聯(lián)劑Y-氨丙基三乙氧基硅烷［NH2C3H6Si（OC2H5）3］對(duì)合成的 Fe3O4磁性納米顆粒進(jìn)行表面修飾，通過(guò)磁性納米顆粒與DNA的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，磁性納米顆粒/DNA復(fù)合物的DNaseⅠ和血清消化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Fe3O4磁性納米顆粒具有結(jié)合及保護(hù)DNA的能力，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性[32]。Xiang等用多聚賴氨酸修飾氧化鐵納米顆粒，凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)和DNA共沉淀實(shí)驗(yàn)表明修飾過(guò)的氧化鐵在生理pH條件下可與DNA結(jié)合，且隨著納米顆粒的增加，對(duì)DNA的結(jié)合力越來(lái)越強(qiáng)，并且氧化鐵納米顆粒與DNA的結(jié)合力可以保護(hù)DNA免受酶的降解，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示多聚賴氨酸修飾的氧化鐵納米顆粒對(duì)細(xì)胞的毒性作用很小[30]。

磁性納米顆粒與DNA通過(guò)靜電作用吸引結(jié)合，這種非特異性相互作用使納米顆粒與DNA形成緊密的復(fù)合物，產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，阻止DNaseⅠ及Mg2+與DNA接觸，使DNaseⅠ不能發(fā)揮消化活性[33]，因此磁性納米顆粒具有很好的酶切保護(hù)效果。He等認(rèn)為，由于納米顆粒的尺寸效應(yīng)使得DNA易于嵌入納米顆粒，導(dǎo)致結(jié)合在納米顆粒上的DNA構(gòu)象發(fā)生變異，這種結(jié)構(gòu)的改變使DNA免于被酶切[34]。

3 磁性納米基因載體研究進(jìn)展

3.1 磁性納米顆粒作為載體在基因轉(zhuǎn)染中的研究

高效的基因輸送技術(shù)是將目的基因運(yùn)送到宿主細(xì)胞，隨后目的基因在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)揮功能。目前有3種主要的基因輸送技術(shù)，即病毒載體、核酸電穿孔和核酸轉(zhuǎn)染，3種系統(tǒng)的效能見(jiàn)表1[27]。病毒載體雖然具有很高的轉(zhuǎn)染效率，但可能會(huì)將病毒載體的基因插入宿主基因組，導(dǎo)致有害基因的表達(dá)。電穿孔也可將外源基因高效地轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主，但電刺激會(huì)導(dǎo)致50%的受體細(xì)胞死亡。通常使用的轉(zhuǎn)染試劑雖然對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育影響不大，但轉(zhuǎn)染效率不高影響了它們?cè)谂R床上的使用。磁性納米顆粒具有良好的結(jié)合與保護(hù)DNA的能力，作為基因載體可以高效轉(zhuǎn)運(yùn)基因進(jìn)入細(xì)胞，并且對(duì)細(xì)胞有很低的毒性，在醫(yī)學(xué)上具有很好的應(yīng)用前景。

Zhang等用PEI包裹的磁性納米顆粒作為載體連接小干擾RNA（siRNA）和含有綠色熒光蛋白（GFP）的質(zhì)粒，在外加磁場(chǎng)的作用下轉(zhuǎn)染3D細(xì)胞，siRNA的轉(zhuǎn)染效率為64%，GFP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率為77%，使用短發(fā)夾RNA（shRNA）質(zhì)粒沉默GFP的表達(dá)，效率達(dá)到 82%[35]。Kievit等用 PEI、PEG 和 CS形成的共聚物包被氧化鐵納米顆粒，提高了納米顆粒的生物相容性，降低了細(xì)胞毒性，該納米顆粒能穩(wěn)定地結(jié)合、保護(hù)DNA，在外加磁場(chǎng)的作用下可以高效地將DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤細(xì)胞和異種移植鼠模型的腫瘤中進(jìn)行表達(dá)[36]。超支化聚乙烯亞胺（HPEI）修飾的磁性納米顆粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，螢光素酶的表達(dá)水平比標(biāo)準(zhǔn)的PEI提高了13倍，并且對(duì)細(xì)胞的毒性作用也大大減小[37]。

自從1988年RNA干擾（RNAi）在線蟲(chóng)體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)后，使用RNAi解決人類(lèi)疾病受到極大關(guān)注，許多科學(xué)家嘗試用RNAi技術(shù)來(lái)治愈mRNA水平的疾病。siRNA能識(shí)別并切割靶mRNA分子，從而導(dǎo)致目的基因不能表達(dá)。使用RNAi技術(shù)治療疾病的主要問(wèn)題是如何將siRNA運(yùn)送至靶細(xì)胞，提高它們?cè)隗w內(nèi)的生物利用度，以及避免核酸酶的消化。為了克服這些難題，迫切需要強(qiáng)大的轉(zhuǎn)運(yùn)載體[38]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，聚合物包被磁性納米顆粒可以攜帶siRNA等多種物質(zhì)進(jìn)入靶器官，并且可以保護(hù)siRNA免受核酸酶的消化[39]。氧化鐵納米顆粒攜帶siRNA可以敲除小鼠腫瘤細(xì)胞內(nèi)GFP基因的表達(dá)[40]。與傳統(tǒng)的基因治療方法相比，在納米顆粒表面修飾靶向性物質(zhì)可以提高治療效能，降低納米顆粒對(duì)細(xì)胞的毒性。通過(guò)這種提高的通透性和滯留效應(yīng)，大分子的治療物質(zhì)積累于腫瘤內(nèi)部。靶向性轉(zhuǎn)運(yùn)方法包括細(xì)胞特異性靶向配體的使用，這種配體可以和細(xì)胞表面的受體結(jié)合。近年來(lái)的一些研究強(qiáng)調(diào)了這些靶向配體在提高運(yùn)送效能方面的重要性[41-44]。研究證明，在納米顆粒表面連上一個(gè)特異性靶標(biāo)肽，可以增加腫瘤對(duì)納米顆粒的吸收量及納米顆粒復(fù)合物的利用度，提高沉默效應(yīng)[45]。鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白靶向的siRNA納米顆粒復(fù)合物顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)[44]，降低腫瘤螢光素酶的活性[46]。

表1 基因輸送系統(tǒng)

3.2 磁性納米顆粒與脂質(zhì)體、細(xì)胞穿膜肽結(jié)合在基因轉(zhuǎn)染中的研究

Yang等用脂質(zhì)體包被攜帶增強(qiáng)型GFP（EGFP）的四氧化三鐵磁性納米顆粒，轉(zhuǎn)染He99肺癌細(xì)胞，結(jié)果表明即使沒(méi)有磁場(chǎng)的作用，包被脂質(zhì)體的磁性納米顆粒轉(zhuǎn)染效率要高于脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率，在外加磁場(chǎng)的作用下轉(zhuǎn)染效率進(jìn)一步提高[2]。細(xì)胞穿膜肽帶正電荷，能攜帶小分子、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，其穿膜能力不依賴于細(xì)胞的內(nèi)吞作用。Song等通過(guò)靜電作用將細(xì)胞穿膜肽Tat肽與磁性納米顆粒DNA結(jié)合，在外加磁場(chǎng)的作用下將此復(fù)合物轉(zhuǎn)染人體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率比沒(méi)有Tat肽存在時(shí)提高了4倍；將該復(fù)合物通過(guò)腰椎注射入鼠脊髓，在動(dòng)物背部從注射部位到腦部移動(dòng)磁鐵，結(jié)果顯示，在外加磁場(chǎng)的作用下目的基因轉(zhuǎn)運(yùn)至靶部位進(jìn)行了表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率比沒(méi)有Tat肽存在時(shí)提高了2倍[47]。

3.3 磁性納米顆粒與病毒載體結(jié)合在基因轉(zhuǎn)染中的研究

病毒載體的靶向性是體內(nèi)基因傳遞的一個(gè)主要難題，將病毒載體與磁性納米顆粒結(jié)合進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在外加磁場(chǎng)的作用下可以實(shí)現(xiàn)基因的靶向運(yùn)輸，提高轉(zhuǎn)染效率。

Kamei等將腺病毒（adenovirus，Ad）基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體結(jié)合到金/氧化鐵磁性納米顆粒（GoldMAN）上形成Ad/GoldMAN復(fù)合物，用該系統(tǒng)轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤細(xì)胞，在外加磁場(chǎng)作用下，與單獨(dú)使用Ad載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染相比，該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)使基因表達(dá)水平提高了1000倍，Ad/GoldMAN復(fù)合物直接進(jìn)入細(xì)胞膜，不依賴于細(xì)胞表面的病毒受體和細(xì)胞的內(nèi)吞作用，這種機(jī)制有助于提高Ad載體的基因表達(dá)效率[48]。Hof?mann等將攜帶GFP基因的慢病毒載體與磁性納米顆粒結(jié)合，在外加磁場(chǎng)作用下轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，GFP獲得高水平的表達(dá)，而在相同條件下沒(méi)有磁性納米顆粒的慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，熒光蛋白的表達(dá)水平很低；相同的情況發(fā)生在原代鼠上皮細(xì)胞、鼠成纖維細(xì)胞、豬皮膚成纖維細(xì)胞上。將慢病毒載體與磁性納米顆粒復(fù)合物注入鼠頸動(dòng)脈后，在外加磁場(chǎng)的作用下可以改變慢病毒顆粒在機(jī)體組織內(nèi)的分布[49]。將溶瘤腺病毒與磁性納米顆粒結(jié)合，在外加磁場(chǎng)的引導(dǎo)下感染腫瘤多藥耐藥細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外加磁場(chǎng)存在時(shí)細(xì)胞對(duì)有磁性病毒的吸收量與沒(méi)有磁性病毒相比增加了10倍，增強(qiáng)了病毒的溶瘤效應(yīng)。將溶瘤腺病毒/磁性納米顆粒復(fù)合物注射入小鼠移植瘤模型，在外加磁場(chǎng)作用下，具有磁性的腺病毒與單獨(dú)的腺病毒相比顯示了更強(qiáng)的溶瘤能力[50]。外源基因可以在Ad載體的介導(dǎo)下進(jìn)入動(dòng)物的腦，如果將Ad載體直接注入鼠胚胎腦室，Ad會(huì)均勻地感染腦室表面的神經(jīng)干細(xì)胞，而不能將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)運(yùn)至鼠胚胎腦室靶部位。將生物素化的Ad載體與鏈霉素結(jié)合的磁性納米顆粒連接到一起，當(dāng)Ad載體/磁性納米顆粒復(fù)合物被注入鼠胚胎腦室后，磁鐵被置于胚胎的頭部，病毒載體/磁性納米顆粒復(fù)合物將攜帶的外源基因運(yùn)送腦的靶部位[51]。

4 結(jié)語(yǔ)

磁性納米顆?？梢詳y帶外源DNA進(jìn)入細(xì)胞及動(dòng)物機(jī)體，當(dāng)磁性納米顆粒/DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后，磁性納米顆粒與外源DNA如何解離，外源DNA如何進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行表達(dá)并發(fā)揮功能，以及與外源DNA解離后的磁性納米顆粒從細(xì)胞中排出的途徑尚無(wú)定論，有待于進(jìn)一步研究。

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