芽胞桿菌菌體蛋白提取方法的比較

胡桂萍 ，賈憲波 ，劉波 ，尤民生

1.福建農林大學 應用生態(tài)研究所，福建 福州 350002；2.福建省農業(yè)科學院 農業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003

芽胞桿菌（Bacillus spp.）為好氧或兼性厭氧的桿菌，一般為革蘭染色陽性，對高溫、放射線和有毒有害化學物質等外界有害因子有很強的抵抗力，廣泛分布于土壤、水、空氣及動物腸道等處。芽胞桿菌處于不良環(huán)境時，細菌細胞質高度濃縮脫水形成芽胞，這是一種抗逆性很強的球形或橢圓形的休眠體，休眠體內富含大量耐熱的小分子酶類、特殊的吡啶二羧酸鈣和帶有二硫鍵的蛋白質，且具有多層次厚而致密的芽胞壁，代謝作用緩慢，卻具有潛在的萌發(fā)力，是抗逆性最強的生命體[1]。

研究表明，芽胞桿菌芽胞的形成、強抗逆性及高抗病性都與其胞內相關蛋白的調控表達有關。如SpoIIE蛋白在芽胞隔膜形成的主要作用因子通過激活轉錄因子Sigma F，誘導特異性前孢子的表達[2]。炭疽芽胞桿菌（B.anthracis）中的Spo0B具有組氨酸激酶和ATP酶活性，通過核苷二磷酸激酶表達誘導核苷三磷酸核苷二磷酸脫磷酸，從而調控芽胞初始形成過程及抗病作用[3]。嗜冷芽胞桿菌（B.psychro?saccharolyticus）中的Hsp33蛋白具有調控有機溶劑降解基因的作用[4]。通過低溫誘導高溫厭氧細菌嗜熱脂肪芽胞桿菌（B.stearothermophilus）TLS33可得到葡糖基轉移酶、抗Sigma B因子、Mrp蛋白質同簇體、二氫乳清酸酶、FeuA-SigW基因轉錄調節(jié)器、RibT蛋白質、磷酸腺苷磷酰硫酸還原酶和特異性前孢子轉錄RsfA激酶共8個相關蛋白，但其中6個參與了芽胞桿菌芽胞形成信號轉導途徑[5]。重組蘇云金芽胞桿菌（B.thuringiensis）中SLH-Ap36融合蛋白的表達可增強其抗病性[6]。芽胞桿菌產芽胞過程中還伴隨產生大量代謝物、酶類、伴胞晶體等，這些物質對環(huán)境中的污染物[7]、有機物和害蟲等具有降解和毒害作用[8,13-15]。因此，加大對芽胞桿菌蛋白質的研究力度和深度，有助于芽胞桿菌資源的開發(fā)和利用。

芽胞桿菌胞壁較厚，易形成芽胞，蛋白提取過程中存在細胞壁破碎困難、破碎不完全、蛋白提取率低等問題，故應進行蛋白破碎提取方法的摸索。我們以具有農藥降解和生物修復功能的巨大芽胞桿菌（B.megaterium）、球形芽胞桿菌（B.sphaericus）和彎曲芽胞桿菌（B.flexus）為材料，比較了沸水浴、超聲波和機械破碎作用下提取的菌體蛋白的含量和質量，建立了芽胞桿菌菌體蛋白高效破碎提取方法，為進一步深入研究上述3種芽胞桿菌的農藥降解機理奠定了基礎，也可為類似革蘭陽性菌菌體蛋白的提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

巨大芽胞桿菌、球形芽胞桿菌、彎曲芽胞桿菌是本實驗室研究人員從菊酯類農藥土中篩選到的菊酯類農藥降解菌。SDS（十二烷基磺酸鈉），丙烯酰胺，Bis（N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺），Tris（三羥甲基氨基甲烷），甘氨酸，鹽酸，過硫酸氨，TEMED（四甲基乙二胺），蛋白分子量標準，溴酚藍，甘油，冰醋酸，乙醇，β-巰基乙醇，考馬斯亮藍R250，甲醇，乙醇。iMark680酶標儀、Bio-Rad小垂直板電泳儀（Bio-Rad公司）；ImageScannerIII掃描儀（GE公司）；SPW-10TJ型超低細菌型超純水器（上海賽鴿電子科技有限公司）。

1.2 菌體培養(yǎng)

從-80℃冰箱中取出巨大芽胞桿菌和球形芽胞桿菌菌種，在含農藥甲黃隆（MSM）的基礎培養(yǎng)基上活化[9]，置30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取單菌落轉入含農藥MSM的液體培養(yǎng)基中，30℃、170 r/min培養(yǎng)10 h，4℃、6000 r/min離心10 min，收集菌體；用10倍體積的0.85%生理鹽水懸浮菌體，10 000 r/min、4℃離心10 min，清洗培養(yǎng)基中的雜蛋白，重復3次。

1.3 蛋白破碎提取

1.3.1 沸水浴破碎提取法 取2 mL細菌懸液，加入0.1 g/mL SDS溶液2 mL，沸水浴10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液貯存于-20℃。

1.3.2 超聲波破碎提取法 取2 mL細菌懸液，置冰浴中超聲波破碎，超聲波功率為500 W，工作3 s、間歇2 s，破碎30 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液貯存于-20℃。

1.3.3 機械破碎提取法 取1 g濕菌體中加入10 mL裂解液并使其懸浮，加入少量玻璃珠，采用QIA?GEN tissuselyserⅡ破碎儀破碎5 min，頻率為30/s，10 000 r/min離心10 min，取上清液貯存于-20℃。

1.4 細菌裂解程度觀察

分別取破碎后的菌懸液，稀釋，涂片，固定，進行革蘭染色，于100倍油鏡下觀察，并采集觀察結果。

1.5 蛋白的SDS-PAGE

采用Bio-Rad小垂直板電泳儀對蛋白樣品進行SDS-PAGE，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為4%。采用銀染法進行凝膠染色，凝膠用Epson Ex?pression 10000XL掃描儀掃描，用Quantity One軟件進行圖像分析。

1.6 蛋白含量測定

用改良型Bradford法蛋白質濃度測定試劑盒測定可溶性全細胞蛋白。采用酶標法，分別配置蛋白含量為0、100、150、200、250、300 μg/L時，考馬斯亮藍G-250與蛋白結合物的D595nm值與蛋白質含量呈線性關系，故可用于測定蛋白質含量。考馬斯亮藍法測定蛋白質含量的標準曲線方程為A=0.0022C+0.3136（r2=0.9912），其中A為吸光度值，C為蛋白濃度?？扇苄匀毎鞍滋崛×坑脝挝惑w積（mL）菌液中所含的蛋白質質量（mg）表示。

2 結果

2.1 不同破碎方法下芽胞桿菌的破碎程度分析

與對照相比，巨大芽胞桿菌、球形芽胞桿菌和彎曲芽胞桿菌經沸水浴、玻璃珠機械破碎和超聲波破碎后，都出現(xiàn)了不同程度的菌體碎片，但破碎程度差異明顯。玻璃珠機械破碎對3種芽胞桿菌細胞的破壞程度最強，完整形態(tài)細胞最少；超聲波破碎對細胞的破壞程度稍弱；而沸水浴對細胞形態(tài)的破壞最差，完整結構的細胞數(shù)量最多。

2.2 不同破碎方法獲得的芽胞桿菌菌體蛋白的SDS-PAGE分析

芽胞桿菌菌體蛋白的SDS-PAGE圖譜見圖2，用不同破碎方法得到的蛋白圖譜存在差異。機械破碎提取的蛋白圖譜條帶最多，最為清晰，著色較深，菌株重復性很好。巨大芽胞桿菌的蛋白譜帶為30～32條，相對分子質量（Mr）為16×103～200×103；球形芽胞桿菌蛋白譜帶為 24～26條，Mr為 18×103～190×103；彎曲芽胞桿菌蛋白譜帶為 28～31 條，Mr為 18×103～180×103。超聲波破碎提取的蛋白條帶較模糊，效果不穩(wěn)定，重復性不好。用該方法提取的巨大芽胞桿菌的蛋白譜帶為 15～20 條，Mr為 15×103～180×103；球形芽胞桿菌蛋白譜帶為13～15條，Mr為18×103～160×103；彎曲芽胞桿菌蛋白譜帶為 13～15 條，Mr為 20×103～150×103。沸水浴提取的蛋白圖譜不僅條帶少、很模糊，同時重復性很差。

2.3 不同破碎方法獲得的芽胞桿菌菌體蛋白的濃度比較

將D600nm為2.0的3種細菌菌液各取50 mL，比較不同破碎方法獲得的菌體蛋白的濃度，結果見表1。機械破碎方法得到的3種細菌的蛋白濃度均為最高，巨大芽胞桿菌、球形芽胞桿菌、彎曲芽胞桿菌蛋白濃度分別為20.247、19.902和18.893 mg/mL；其次是超聲波破碎提取的菌體蛋白濃度，依次分別為10.572、9.438和 10.424 mg/mL；沸水浴破碎提取的效果最差，蛋白提取率很低，蛋白濃度依次僅分別為1.366、1.119和1.136 mg/mL。

3 討論

雖然已有很成熟的蛋白提取方法，但從極端環(huán)境中分離的芽胞桿菌具有抗逆和易產芽胞的特點，實驗室常規(guī)方法不一定適用。因此，針對產芽胞這一類革蘭陽性菌，直接使用某一常規(guī)方法提取蛋白常得不到理想結果[17-18]。蛋白提取的關鍵步驟是細胞破碎和蛋白質溶解，不同破碎方法提取的蛋白質效果不同[10]。細菌裂解后釋放至胞體內及膜上的蛋白質比例與裂解程度相關，裂解率越高，釋放的蛋白質頁越多，此時細胞結構越不完整，可通過細胞染色電鏡觀察來指示細胞的破碎程度[11]。

表1 不同破碎方法所得菌體蛋白的濃度

圖1 不同破碎方法處理的芽胞桿菌革蘭染色（×1000）

圖2 不同破碎方法提取的芽胞桿菌蛋白質的SDS-PAGE

細菌細胞破碎方法主要有超聲波、高壓勻漿、研磨、高速珠磨、酶溶、有機溶劑滲透、低滲裂解等[16-18]，各具優(yōu)劣。酶溶、有機溶劑滲透、低滲裂解主要是加入一些降解細胞壁成分的物質，如溶菌酶等，有很好的裂解作用，但容易將外源蛋白引入樣本，影響樣本蛋白質的后期分析；而超聲波、高壓勻漿、研磨、高速珠磨方法主要通過機械方式破壞細胞壁，不會將外源物質引入樣本，有利于蛋白質組的研究，但裂解程度一般[12]。巨大芽胞桿菌和球形芽胞桿菌為革蘭陽性菌，細胞壁難以破碎，因此宜采用較為劇烈的方法裂解。本實驗分別采用超聲波、沸水浴和玻璃珠機械破碎法提取芽胞桿菌蛋白，通過SDS-PAGE分析和Bradford法定量，發(fā)現(xiàn)用玻璃珠機械破碎方式提取的蛋白濃度高，重復性好。與其他方法相比，用玻璃珠機械破碎方式得到的蛋白條帶多，譜圖全，提取率高。用超聲波破碎芽胞桿菌，存在超聲聲頻和聲能及超聲時間的影響，頻率太低超聲空化引起的沖擊波和剪切力不足，芽胞桿菌細胞壁破碎不徹底，蛋白提取不充分；超聲強度太大，容易使溶液產生泡沫，易導致蛋白質變性。沸水浴易使蛋白變性，即使細胞破碎完全，蛋白的提取率還是很低。因此，通過玻璃珠機械破碎提取芽胞桿菌的蛋白質效果最好，可用于芽胞桿菌等革蘭陽性菌的蛋白質組學研究。

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