王聰，杜金華，張開利，金玉紅

1(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，山東 泰安，271018)

2(山東泰山啤酒有限公司，山東 泰安，271000)

脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是一種重要的水解酶類［1］。在植物中，大多數(shù)脂肪酶是作為能量儲(chǔ)備在種子里［2］。Sullivan 和Howe 在1933 年第1 次發(fā)現(xiàn)在小麥種子里存在脂肪酶［3］。作為麥粒的重要組成部分，麩皮和胚芽中都含有脂肪酶，并且未發(fā)芽的種子里的脂肪酶酶活比發(fā)芽的種子里低［4］。

在糖化過程中，小麥芽中的脂肪氧化酶(Lox)會(huì)催化糖化醪中解離出來的游離亞油酸、亞麻酸以及其他具有順，順-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸以及這些酸的甘油酯［5］，生成氫過氧化脂肪酸，氫過氧化脂肪酸進(jìn)一步反應(yīng)生成單羥基、雙羥基和三羥基十八碳烯酸等羥基不飽和脂肪酸，三羥基十八碳烯酸被認(rèn)為是反-2-壬烯醛的前體［6］，而反-2-壬烯醛具有紙板味，是產(chǎn)生啤酒老化風(fēng)味的主要物質(zhì)［7－8］。而脂肪氧化酶的底物主要是小麥芽中的脂肪酶水解原料中甘油酯而來。因此，小麥芽中的脂肪酶是導(dǎo)致啤酒產(chǎn)生老化物反-2-壬烯醛的源頭。目前，小麥芽已經(jīng)廣泛作為釀造啤酒的原料，了解小麥芽中脂肪酶的變化，從而找到合理的方法抑制脂肪酶的酶活，對(duì)小麥啤酒的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料與試劑

小麥(魯麥21);Tris(Scientific research special);HCl(萊陽市康德化工有限公司);Na2HPO4、NaH2PO4，天津巴斯夫化工有限公司;曲拉通X-100，Sigma;對(duì)硝基苯酚丁酸酯，青島沃克化工有限公司。

1.2 儀器

EBC-LF 麥芽標(biāo)準(zhǔn)粉碎機(jī)，北京德之杰公司;LRH-250-A 生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠;AL204電子天平，梅特勒-托利多有限公司;101A 電熱鼓風(fēng)干燥箱，黃驊市卸甲綜合電器廠;UV-2100 型紫外可見分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司;2004-21(501)數(shù)顯水浴鍋，國華電器;DS-8510DTH 超聲波清洗器，上海生析超聲儀器有限公司;TGL-16M 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小麥制麥工藝

參照J(rèn)in et al 的方法［9］，小麥芽的糖化與分析參照QB/T 1686 －2008。

成品小麥芽指標(biāo):水分6.62%，糖化時(shí)間4 min，色度5.96EBC，濁度2.69EBC，黏度1.51cP，pH5.99，酸度0.93，氨基氮147.46 mg/L，庫值35%。

1.3.2 脂肪酶酶活測定

1.3.2.1 粗酶提取

成品麥芽磨碎，磨篩孔0.2 mm［10］。取5g 磨碎麥芽(0.000 1 g)轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶中，加入50 mL 50 mmoL/L Tris-HCL(pH 7.0)，在冰浴中放置15 min，期間間歇搖動(dòng)。溶液轉(zhuǎn)入50 mL 離心管中，在10 000 r/min、4℃［10］下離心10 min［11］。上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾轉(zhuǎn)入10mL 容量瓶中并貯存于4℃的冰箱中［10］。

1.3.2.2 底物溶液制備

50 mmoL/L 對(duì)硝基苯酚丁酸酯儲(chǔ)備液的制備［12］略有改動(dòng):將88 μL 對(duì)硝基苯酚丁酸酯加到10 mL 容量瓶中，用乙腈定容。

2 mmoL/L 對(duì)硝基苯酚丁酸酯的制備:取4 mL 儲(chǔ)備液于100 mL 容量瓶中，用含0.4% TritonX-100 的蒸餾水定容(現(xiàn)用現(xiàn)配儲(chǔ)于棕色瓶)。

1.3.2.3 酶分析

200 μL 粗酶液加到比色管中，加入4 600 μL 50 mmoL/L Tris-HCl 緩沖液(pH8.0)在37℃循環(huán)水浴中保溫5 min，再加入200 μL 底物溶液，反應(yīng)30 min，煮沸3 min 終止反應(yīng)，空白為加底物之前煮沸3 min，8 000 r/min 離心5 min 后，410 nm 測定吸光值A(chǔ)1;對(duì)照為4 800 μL tris-HCl 緩沖液在37℃循環(huán)水浴中保溫5 min，再加入200 μL 底物溶液，反應(yīng)30 min，反應(yīng)后煮沸3 min，以不煮沸的作為空白，8 000 r/min 離心5 min，410n m 測定吸光值A(chǔ)2。即A(吸光值的變化)=A1－A2。

1.3.2.4 計(jì)算與結(jié)果表達(dá)

脂肪酶酶活單位表示為:1g 干麥芽(每mL 麥汁)每分鐘在410nm 處增加吸光值0.1 為1 個(gè)酶活單位，有改動(dòng)［10］。計(jì)算公式如下:

式中:A，酶反應(yīng)在410nm 處的吸光值變化;30，酶反應(yīng)時(shí)間，min;m，提酶所需麥芽粉的質(zhì)量，g;50 000，提酶所需緩沖液的體積，μL;200，反應(yīng)所需酶浸出液的體積，μL;m1，麥芽的含水量，g/g;1 000，麥汁的體積，μL。

1.3.3 酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.3.3.1 最適溫度的確定

分別將上述1.3.2(3)中的溫度改為25、30、35、37、40、45 ℃，測定脂肪酶的酶活，找到其最適溫度。

1.3.3.2 最適pH 值的確定

分別將上述1.3.2(3)中的pH 值改為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，測定脂肪酶的酶活，找到其最適pH。

1.3.3.3 溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

(1)分別將粗酶液貯藏在30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃下保溫10 min 后，在冰水浴中迅速冷卻，10 000 r/min、4 ℃下離心10 min，上清液即為粗酶液，在脂肪酶的最適溫度和pH 下測定酶活。

(2)分別將粗酶液貯藏在35、45、55 ℃下60 min，每10 min 取樣測定，65、70 ℃每1 min 取樣測定酶活。

1.3.3.4 pH 對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

(1)分別向200 μL 粗酶液中加入800 μL 不同pH 的緩沖液(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)，在37 ℃下保溫10 min 后再加入pH8.0 的緩沖液3 800 μL 和200 μL 底物，測定脂肪酶的酶活。

(2)分別向200 μL 粗酶液中加入800 μL pH 為5.5、6.0 的緩沖液，在37 ℃下保溫90 min，期間每10 min 加入pH8.0 的緩沖液3 800 μL 和200 μL 底物，測定脂肪酶的酶活。

1.3.3.5 金屬離子對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的研究

分別向酶液中加入金屬離子(Cu2+、Ca2+、Mn2+、Fe3+、Al3+、Mg2+、Ba2+、Fe2+)和EDTA 的儲(chǔ)備液，使金屬離子的終濃度達(dá)到2 mmoL/L，將酶液在37 ℃保溫10 min 后，在最適溫度及pH 值下測定脂肪酶的酶活。

1.3.3.6 小麥芽不同部位脂肪酶的測定

將干燥好的成品麥芽置于鐵絲篩網(wǎng)中，輕輕揉動(dòng)，將麥芽的根收集，測定胚根的酶活;待根完全去除后，加大揉動(dòng)力度，使胚芽分離，收集用于測定胚芽的酶活;剩余部分為籽粒的酶活。

1.3.3.7 EBC 糖化麥汁酶液的提取

用一次性注射器在不同時(shí)間點(diǎn)(55 min 內(nèi)每隔5 min 取樣)從糖化醪中取出2 mL 糖化液，冰水浴冷卻，10 000 r/min 離心5 min，上清液即為粗酶液。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

文中實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3 次平行試驗(yàn)的平均值。采用dps7.05 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。差異性采用Turkey 法進(jìn)行多重比較，置信水平95%(P=0.05)。具有相同字母表示兩者無顯著差異(P＞0.05)，沒有相同字母表示兩者存在顯著性差異(P＜0.05)，字母順序按均值大小排列。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶最適反應(yīng)溫度的確定

從圖1 可以看出，脂肪酶在25 ～37 ℃，隨著溫度的上升酶活變高，到37℃時(shí)，酶活達(dá)到最大;37 ～45℃，隨著溫度的上升酶活變低;37℃的酶活與其他溫度下的有顯著性差異。因此，37℃為其最適反應(yīng)溫度。

圖1 酶反應(yīng)溫度曲線Fig.1 Enzyme reaction temperature curve

2.2 脂肪酶最適反應(yīng)pH 的確定

從圖2 可以看出，脂肪酶在pH6.0 ～8.0 時(shí)，隨著pH 的增大酶活增大，在pH 為8.0 時(shí)，達(dá)到最大酶活。在pH8.0 ～9.0 時(shí)，隨著pH 的增大酶活變小，pH8.0 時(shí)的酶活與其他pH 下的有顯著性差異。因此，pH8.0 是最適反應(yīng)pH。

圖2 酶反應(yīng)pH 曲線Fig.2 Enzyme reaction pH curve

2.3 溫度對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響

2.3.1 不同溫度對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響

從圖3 可以看出，隨著保溫溫度的上升，酶活在逐漸降低，30 ℃與空白(4 ℃)并無明顯差異，說明脂肪酶在10 min 內(nèi)，30 ℃以下，隨溫度的上升酶的失活并無明顯變化，35℃以上隨著溫度的上升，除45、50℃2 點(diǎn)無明顯差異外，酶的失活明顯，在60 ℃時(shí)10 min 后酶活僅僅為空白的21.00%，65 ℃下保溫10 min 后，酶已經(jīng)失活，這說明脂肪酶并不耐高溫。

2.3.2 保溫時(shí)間對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響

圖3 不同保溫溫度條件下酶活變化Fig.3 Enzyme activity change under different temperature condition

從圖4 可以看出，35 ℃下保溫1 h 酶的失活并不大，降為原來的88.37%。如果麥汁糖化在35 ℃下停留，對(duì)于啤酒是不利的，停留時(shí)間越長，脂肪酶酶解脂類產(chǎn)生的不飽和脂肪酸如亞油酸、亞麻酸的含量就會(huì)越多，麥汁中的脂肪氧化酶會(huì)將這些具有順順1，4戊二烯結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸降解產(chǎn)生三羥基十八碳烯酸，三羥基十八碳烯酸又會(huì)進(jìn)一步分解成反-2-壬烯醛，反-2-壬烯醛被認(rèn)為是導(dǎo)致啤酒產(chǎn)生紙板味的老化物質(zhì)。脂肪酶在45 ℃下酶活下降比較明顯，保溫60 min 后酶活只占空白的46.81%;55 ℃下，脂肪酶的失活非常迅速，并且不同時(shí)間點(diǎn)的酶活有顯著性差異，在60 min 時(shí)，酶活降為0u/g;65 ℃與70 ℃下，脂肪酶失活更為迅速，65 ℃下，1 min 后酶活就降至12.61%，6 min 左右就已經(jīng)失活;70 ℃下，1 min 后酶活就降至9.09%，5 min 左右就已經(jīng)失活。

2.4 pH 值對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響

2.4.1 不同pH 值對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響

從圖5 可以看出，脂肪酶在不同的pH 環(huán)境中穩(wěn)定性不同。以在不同pH 條件下保存后，酶活最高點(diǎn)為100%作圖，脂肪酶在pH 5.5 以及6.0 下，酶活沒有顯著性差異。因此，脂肪酶在pH 5.5 和6.0 下最為穩(wěn)定;在pH 8.5 條件下最不穩(wěn)定。

2.4.2 pH 值隨時(shí)間對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響

從圖6 可以看出，在pH 值5.5 和6.0 條件下，酶在37℃下保存60 min，酶活分別下降至初始值的95.11%和91.11%，失活并不嚴(yán)重，由于麥芽在糖化過程中，麥汁的pH 處在5.5 ～6.0，此pH 下對(duì)脂肪酶的破壞力較小，因此，糖化過程的pH 條件對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性影響不大。

2.5 金屬離子對(duì)脂肪酶的影響

從表1 可以看出，F(xiàn)e3+對(duì)脂肪酶有強(qiáng)烈的抑制作用，可以使脂肪酶的酶活降至54.95%;Cu2+、Mn2+、Al3+對(duì)脂肪酶的抑制作用較小，分別降為80.68%、92.77%和89.74%;Fe2+、Mg2+、Ba2+對(duì)脂肪酶的抑制作用無顯著性差異;Ca2+、EDTA 對(duì)脂肪酶有強(qiáng)烈的激活作用，分別上升至106.41%和110.53%。

圖4 溫度對(duì)酶活的影響Fig.4 Influence of temperature with enzyme activity

圖5 pH 對(duì)酶活的影響Fig.5 Influence of pH with enzyme activity

表1 金屬離子對(duì)酶活的影響Table 1 Influence of metal ion with enzyme activity

金屬離子(2 mmoL/L) 脂肪酶的相對(duì)酶活/%Mg2+ 104.21 ±0.84 bc Al3+ 89.74 ±0.79d Ca2+ 106.41 ±0.32ab Ba2+ 102.38 ±0.69bc EDTA 110.53 ±2.46 a

2.6 發(fā)芽過程中脂肪酶酶活的變化

從圖7 可以看出，原麥中的脂肪酶酶活為2.17 u/g，小麥在浸麥結(jié)束后，麥芽的脂肪酶變化沒有明顯差異，但在發(fā)芽開始后酶活明顯增加，從第1 ～4 天，酶活逐漸上升，到第4 天達(dá)到最大值，分別為1.77、3.00、4.15、6.15 和8.52 u/g。第5 天酶活開始下降，第5 ～6 天的酶活下降并不明顯，分別為6.50 u/g 和6.39 u/g。干麥芽的酶活下降主要是高溫干燥導(dǎo)致麥芽中部分脂肪酶變性失活，失活率為27.06%，酶活降為4.66 u/g。

2.7 小麥芽中不同部位的脂肪酶酶活變化

圖6 pH5.5 和6.0 對(duì)酶活的影響Fig.6 Influence of pH 5.5 and pH 6.0 with enzyme activity

圖7 發(fā)芽過程中的酶活變化Fig.7 Enzyme activity change in the process of germination

從圖8 可以看出，小麥芽不同部位脂肪酶的酶活有顯著性差異，麥芽籽粒的酶活最大為8.01 u/g，其次胚芽為7.55 u/g，最后胚根為6.83 u/g。胚根在綠麥芽干燥之后去除，對(duì)麥芽的糖化不會(huì)產(chǎn)生任何影響，麥芽中籽粒和胚芽的存在會(huì)由于其含有脂肪酶而對(duì)麥芽的糖化產(chǎn)生不利的影響。

圖8 小麥芽不同部位的酶活變化Fig.8 Enzyme activity change in different parts of wheat malt

2.8 協(xié)定糖化過程中脂肪酶酶活的變化

從圖9 可以看出，對(duì)去除和未去除胚芽的小麥芽進(jìn)行糖化，比較糖化過程中麥汁脂肪酶的酶活，發(fā)現(xiàn)去除胚芽的小麥芽在糖化過程中，脂肪酶的酶活一直比有胚芽的高。不管有沒有去除胚芽，在糖化開始不久，酶活都有一個(gè)先上升后下降的過程，這主要是因?yàn)閯傞_始脂肪酶沒有完全溶出，隨著糖化時(shí)間的延長，脂肪酶逐漸溶出，酶量逐漸增加，其增加量大于失活量，因此，酶活不斷增加;隨后出現(xiàn)下降是因?yàn)槊噶恳呀?jīng)不再增加或者增加量小于失活量。沒有去除胚芽的小麥芽在糖化過程中，麥汁中的脂肪酶的酶活在45 min(60℃)前下降比較緩慢，45 min 時(shí)脂肪酶的失活率僅僅為25.58%;從45 min 到55 min(70℃)，脂肪酶失活比較明顯，失活率為89.99%。去除胚芽的小麥芽在糖化過程中，麥汁中的脂肪酶下降比較明顯，到55 min 時(shí)，酶活已經(jīng)降為0 u/mL。

圖9 協(xié)定糖化過程中的酶活變化Fig.9 Enzyme activity change in the process of standard saccharification

3 結(jié)論

(1)小麥芽脂肪酶最適溫度為37℃;最適pH 為8.0;4 ～35 ℃脂肪酶的熱穩(wěn)定性較好，35 ℃、45 ℃下保溫60 min 其活力仍保持率分別為88.37% 和46.81%，55 ℃保溫60 min 酶失活;pH 5.5 和6.0 對(duì)脂肪酶的破壞力相對(duì)較小，保溫60 min 其活力仍可分別保持在95.11%和91.11%;Fe3+對(duì)脂肪酶有較強(qiáng)的抑制作用;Cu2+、Mn2+、Al3+對(duì)脂肪酶的抑制作用較小;Fe2+、Mg2+、Ba2+對(duì)脂肪酶的抑制作用無顯著性差異;Ca2+、EDTA 對(duì)脂肪酶有較強(qiáng)的激活作用。

(2)小麥芽在發(fā)芽的第4 天酶活達(dá)到最大值，為8.52 u/g，隨后酶活下降，干燥會(huì)破壞部分脂肪酶的酶活，損失為27.06%。小麥芽不同部位脂肪酶的酶活有顯著性差異，麥芽籽粒的酶活最大為8.01 u/g，其次胚芽為7.55 u/g，最后胚根為6.83 u/g。

(3)EBC 麥汁糖化過程中無胚芽麥芽的脂肪酶酶活比含胚芽的低，并且酶的失活速度也比較大，在55 min(70 ℃)時(shí)，脂肪酶會(huì)完全失活。

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