漆酶對共基質(zhì)體系下吲哚的去除研究

任大軍，鮑 欣，張元元，吳高明

（1.武漢科技大學資源與環(huán)境工程學院，湖北 武漢，430081；2.武漢鋼鐵（集團）公司安全環(huán)保部，湖北 武漢，430083）

吲哚是一種典型的氮雜環(huán)化合物（NHCs），廣泛存在于焦化、染料、制藥、農(nóng)藥等工業(yè)的廢水及木材防腐處理場地周圍的土壤和地下水中［1］。該類物質(zhì)生物去除性較差，具有致癌、致畸、致突變的性質(zhì)［2］。實際廢水的水體成分復雜，不僅含有吲哚，還共存其他有機污染物如苯酚，它們會對微生物產(chǎn)生抑制作用，故采用一般的生物方法難以處理［3］。漆酶（Laccase）是一種含銅的多酚氧化酶（p－diphenol oxidase EC.1.10.3.2），具有較高的氧化還原電勢，在沒有H2O2和其他次級代謝產(chǎn)物存在的情況下，可對有機污染物的氧化起到催化作用。漆酶可以氧化的底物包括：酚類及其衍生物、芳胺及其衍生物和芳香羧酸及其衍生物等［4］。本文以吲哚為處理對象，選擇廢水中常見的酚類污染物苯酚作為吲哚的共存因子，以漆酶為處理試劑，研究復雜體系中各因子與漆酶的相互作用機制，以期為NHCs污染水體的修復提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 酶與化學試劑

漆酶（白腐真菌側(cè)耳屬Pleurotus ostreatus）和2，2－連氮－雙－（3－乙基苯并噻吡咯啉－6－磺酸）（ABTS），由Sigma公司生產(chǎn)，純度高于99.9%；吲哚、苯酚、醋酸、醋酸鈉均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 漆酶對吲哚的去除試驗

稱取一定質(zhì)量的純漆酶，加入一定量的蒸餾水配成酶溶液，使其實測酶活力值與實驗所需酶活力值誤差不超過5%。

將醋酸和醋酸鈉分別用蒸餾水定容后避光保存，配制成0.1mol／L的溶液后，再將兩種溶液按不同的體積比配制成試驗所需pH值的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液，其醋酸根的離子濃度始終保持在0.1mol／L，記為0.1M。

以I表示吲哚，P表示苯酚，分別按如下配方配制出兩種混合反應體系：

（1）I單基質(zhì)體系：1mL的醋酸－醋酸鈉緩沖液（0.1M）、1mL的漆酶溶液、0.5mL的吲哚和0.5mL的蒸餾水。

（2）I＋P共基質(zhì)體系：1mL的醋酸－醋酸鈉緩沖液（0.1M）、1mL的漆酶溶液、0.5mL的吲哚和0.5mL的苯酚。

兩種體系的總體積均為3mL，將反應液放入10mL的HACH管中，在常溫避光條件下反應一段時間后，測溶液中剩余苯酚和吲哚的濃度。

1.2.2 檢測方法

吲哚、苯酚濃度的測定：樣品先經(jīng)過0.45μm的濾膜，然后采用Agilent公司的HPLC1100高效液相色譜儀測定吲哚及苯酚濃度。檢測條件為：流動相為甲醇和水（體積比為60∶40），流速為0.8mL／min，檢測波長為270nm，進樣量為20μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應時間對漆酶去除吲哚的影響

吲哚和苯酚初始濃度均為30mg／L、漆酶溶液初始活力值為0.33U／mL、體系pH值為3.5時，不同體系中吲哚的去除率隨反應時間的變化如圖1所示。由圖1中可見，漆酶對兩類基質(zhì)體系吲哚的去除率都隨著時間的延長而升高，共基質(zhì)體系中吲哚的去除率基本上高于單基質(zhì)體系相應值，反應時間為12～24h時，共基質(zhì)體系中吲哚的去除率比單基質(zhì)體系中吲哚的去除率約高10個百分點，這表明苯酚的加入促進了漆酶對吲哚的去除。研究發(fā)現(xiàn)漆酶單獨去除吲哚、苯酚及去除吲哚和苯酚混合物的反應過程中體系顏色變化都非常明顯，只含有苯酚的去除體系由白色變?yōu)闇\黃色；只含有吲哚的去除體系由白色變?yōu)橥该鼽S色；含有苯酚和吲哚的去除體系由白色先變?yōu)辄S色后又變?yōu)榭Х壬７磻?8h時共基質(zhì)體系中有咖啡色物質(zhì)沉淀出來，上清液顏色變淡；而單基質(zhì)體系中沒有沉淀，液體顏色無太大變化；只含苯酚和吲哚的體系中，液體顏色始終是無色透明的。以上現(xiàn)象表明，沒有漆酶的情況下，苯酚不能與吲哚發(fā)生反應；苯酚的加入改變了漆酶對共基質(zhì)中吲哚的去除作用機制。

圖1 反應時間對不同體系中吲哚去除率的影響Fig.1 Effect of reaction time on indole removal rate

2.2 pH值對漆酶去除吲哚與苯酚的影響

吲哚和苯酚的初始濃度均為30mg／L、漆酶溶液初始活力值為0.33U／mL時，不同pH值下反應24h時吲哚和苯酚去除率如圖2所示。由圖2中可見，漆酶對單基質(zhì)體系中吲哚的去除率隨著pH值的升高而降低，而對共基質(zhì)體系中吲哚的去除率先降低后增高。共基質(zhì)體系中，pH值為3.5時吲哚的去除率最高，為50.7%，pH值為5.5時吲哚的去除率達到最低值29.6%。pH值為6.5時，與單基質(zhì)體系相比，共基質(zhì)體系中吲哚的去除率提高了約30個百分點。

圖2 不同pH值體系下漆酶對吲哚和苯酚的去除效果Fig.2 Effect of pH on indole and phenol removal rate

由圖2中還可見，共基質(zhì)體系中苯酚的去除率隨著pH值的增大而提高，pH值為6.5時，反應24h時苯酚的去除率接近60%。共基質(zhì)體系中，當pH值為3.5～5.0時混合體系中吲哚的去除率大于苯酚的去除率；而當pH值為5.0～6.5時，苯酚的去除率大于吲哚的去除率，這是由于漆酶催化去除底物的最合適pH值與底物的化學結(jié)構(gòu)有關(guān)。底物與酶活中心的氧化還原電勢差決定了底物的氧化速率［4］，苯酚的結(jié)構(gòu)較簡單，其氧化還原電勢較低（＜0.8V）［5］，漆酶更容易與其先發(fā)生反應［6］。吲哚的溶解度較低，不易接近酶活中心，且氧化還原電勢（＜1.035V）高于苯酚［7］。隨著pH值從6.5逐漸降至3.5，吲哚易與溶液中H＋形成相應的共軛酸［8］，增強了吲哚的親水特性，使吲哚更容易接近酶分子表面，從而提高了吲哚的去除率。而隨著pH值從3.5逐漸升高至6.5，苯酚的氧化還原電勢減小，漆酶的氧化還原電勢基本不變［4］，苯酚與酶活中心的電勢差增大，漆酶氧化苯酚的速率加快。酚類化合物也可以作為漆酶的介體物質(zhì)，漆酶催化反應速率是由酚類化合物氧化態(tài)的形成速率決定［9］。共基質(zhì)中當溶液pH值高于5.0，苯酚的氧化產(chǎn)物生成的速率加快，然后苯酚中間產(chǎn)物與漆酶組成了新的介體系統(tǒng)，促進了吲哚的去除。因此在較高的pH值下，吲哚的去除率反而升高。

2.3 酶初始活力值對漆酶去除吲哚與苯酚的影響

選取pH值為3.5和6.5，吲哚和苯酚的初始濃度均為30mg／L，不同酶初始活力值下反應24 h時吲哚和苯酚的去除率如圖3所示。由圖3中可見，在兩類基質(zhì)中漆酶對苯酚、吲哚的去除率隨著酶初始活力值的增大而提高；共基質(zhì)體系中吲哚的去除率基本上高于單基質(zhì)吲哚的去除率；當溶液pH值為3.5時，吲哚的去除率高于溶液pH值為6.5時的相應值。提高漆酶的活力值有利于增加酶與吲哚及苯酚的接觸機會，從而提高了苯酚與吲哚的去除率。而中性偏酸性的環(huán)境及酶初始活力值的增大都有利于苯酚中間產(chǎn)物的生成，然后苯酚中間產(chǎn)物可與漆酶組成新的介體系統(tǒng)，促進了漆酶對吲哚的去除。由于漆酶初始活力值的大小是通過改變漆酶溶液的濃度獲得，酶初始活力值與漆酶的用量成正比，因此與單基質(zhì)體系中去除吲哚相比，苯酚的加入減少了漆酶的用量。

圖3 酶初始活力值對苯酚與吲哚去除率的影響Fig.3 Effect of enzyme activity on phenol and indole removal rate

2.4 苯酚濃度對漆酶去除吲哚的影響

吲哚初始濃度為30mg／L、漆酶溶液初始活力值為0.33U／mL、pH 值為3.5和6.5時，不同苯酚初始濃度下反應24h時吲哚的去除率如圖4所示。由圖4中可見，苯酚初始濃度與吲哚的去除率具有良好的線性相關(guān)性，苯酚的存在可以增強漆酶對吲哚的去除效果。Calcaterra等［10］發(fā)現(xiàn)在對苯二酚、酚紅存在的情況下，漆酶可以氧化非酚類化合物。一般認為酚類化合物并不是像2，2－連氮－雙－（3－乙基苯并噻吡咯啉－6－磺酸）（簡稱ABTS）那樣傳統(tǒng)意義上的介體，因為它會被漆酶去除且中間產(chǎn)物不穩(wěn)定［11］。González［12］研究了16種酚類化合物對苯甲醇的電化學行為，發(fā)現(xiàn)這些酚類化合物與1－羥基苯并三唑（HBT）及藜蘆醇（VA）的行為類似，認為酚類化合物與漆酶的接觸方式屬于H－abstraction氧化機理。因此苯酚及其氧化產(chǎn)物與漆酶可能組成了新的“介體”系統(tǒng)，促進了吲哚的去除。隨著溶液中苯酚初始濃度升高，苯酚氧化態(tài)形成的速率增大，反應加快，吲哚的去除率升高。

3 討論

圖4 苯酚初始濃度對吲哚去除率的影響Fig.4 Effect of phenol initial concentration on indole removal rate

酶的催化反應速率與溶液pH值、水中氧氣濃度、底物種類及酶種類有關(guān)［4－6］。底物的電子轉(zhuǎn)移至漆酶活性中心T1Cu的速率是限制漆酶催化反應的關(guān)鍵因素。電子的轉(zhuǎn)移速率與T1Cu和底物的氧化還原電勢差有關(guān)［4］。溶液pH值的變化對漆酶的氧化還原電勢影響不大，T1Cu氧化還原電勢約為0.785V［4］。吲哚的氧化還原電勢隨著溶液pH 值的增大而減小（＜1.035V）［7，13］，但是漆酶的酶促反應不僅與底物的氧化還原電勢有關(guān)，還與底物的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)［4－5］。吲哚環(huán)上的電荷密度比苯酚環(huán)上低，吲哚的空間體積位阻效應增大，其疏水性也增大，不利于吲哚接近漆酶活性中心［14］。吲哚的環(huán)上含有N原子，隨著溶液pH值的降低，易從溶液中獲取H＋，生成相應的共軛酸［8］，增強了吲哚的親水特性，使吲哚更容易接近酶分子表面，從而提高吲哚的去除率。因此，吲哚在酸性條件下去除效果更好，這也與漆酶和單基質(zhì)吲哚反應現(xiàn)象相符。當加入苯酚以后，漆酶與苯酚的氧化還原電勢差和溶解性都高于吲哚，苯酚將優(yōu)先被漆酶氧化，而當溶液的pH值從3.5緩慢升至6.5時，苯酚的氧化還原電勢隨著pH值的增大而減?。?］，因此，漆酶與苯酚的氧化還原電勢差增大。氧化還原電勢差越大，電子的轉(zhuǎn)移速度越快，當溶液pH值逐漸升高時，較高的氧化還原電勢差會促使電子從苯酚向T1Cu更快地轉(zhuǎn)移，從而使漆酶氧化更多的苯酚。目前酚類化合物也被發(fā)現(xiàn)可以促進漆酶去除污染物［9－11］，溶液pH值在中性偏酸性時，溶液中苯酚會先與漆酶反應；而后苯酚的氧化產(chǎn)物又充當了漆酶的“介體物質(zhì)”，促進了吲哚的去除。當溶液pH值從6.5緩慢降至3.5時，苯酚的氧化產(chǎn)物濃度也隨著下降，“介體物質(zhì)”對吲哚的去除作用不占主導地位。在較低的pH值下，溶液中吲哚的去除主要依靠漆酶的氧化。

通過對比單基質(zhì)和共基質(zhì)下吲哚的去除率發(fā)現(xiàn)，漆酶不僅可以同時去除苯酚和吲哚，苯酚的存在還促進了吲哚的去除。在含有苯酚的反應體系中發(fā)現(xiàn)了沉淀。Michaela［15］也發(fā)現(xiàn)用漆酶處理蘋果汁中酚類化合物時有褐色的沉淀。Hu［16］研究發(fā)現(xiàn)漆酶在有苯酚存在的情況下，對靛藍染料廢水的脫色率增加了80%。劉友勛［17］認為介體會先與漆酶發(fā)生反應生成介體氧化形態(tài)，然后在氧化態(tài)介體的介導作用下，染料被聚合最終生成不溶于水的沉淀物。吲哚為藍色染料靛藍的母核，與靛藍有某些相似的化學性質(zhì)，因此吲哚可能被苯酚的氧化態(tài)中間產(chǎn)物在介導作用下生成聚合物沉淀，使溶液中吲哚的濃度迅速降低。進入液相之前，溶液中的沉淀物質(zhì)及顏色將會被截留在0.45μm的濾膜上，從而使含有苯酚的情況下，漆酶對吲哚的去除作用遠大于不含有苯酚的情況。

4 結(jié)論

（1）與單基質(zhì)體系相比，含有苯酚的體系中，漆酶對吲哚的去除效果更好。

（2）在共基質(zhì)體系中，漆酶不僅可以同時去除苯酚和吲哚，苯酚的存在還改變了漆酶對吲哚的去除機理，促進了漆酶對吲哚的去除。共基質(zhì)體系中，苯酚濃度與吲哚的去除率有良好的線性相關(guān)性，且苯酚的加入可以減小漆酶的用量。

（3）共基質(zhì)體系中漆酶對吲哚的去除有兩個較優(yōu)pH值，分別為3.5和6.5。

［1］Li Y M.，Gu G W，Zhao J，et al.Anoxic degradation of nitrogenous heterocyclic compounds by acclimated activated sludge［J］.Process Biochemistry，2001，37：81－86.

［2］Zille A，Ramalho P，Tzanov T，et al.Predicting dye biodegradation from redox potentials［J］.Biotechnology Progress，2004，20（5）：1588－1592.

［3］任大軍，顏克亮，劉飛虎，等.不同共代謝基質(zhì)對白腐菌去除吲哚的作用研究［J］.環(huán)境科學學報，2007，27（2）：206－212.

［4］Mülazimolu I E，Yllmaz E.Quantitative determination of phenol in natural decayed leaves using procaine modified carbon paste electrode surface by cyclic voltammetry［J］.Desalination，2010，256：64－69.

［5］Keum Y S，Li Q X.Fungal laccase－catalyzed degradation of hydroxy polychlorinated biphenyls［J］.Chemosphere，2004，56 （1）：23－30.

［6］Xu F.Dioxygen reactivity of laccase［J］.Applied Bi－ochemistry and Biotechnology，2001，95（2）：125－133.

［7］Mónica S E，Luísa C C，Luísa M F，et al.Analysis of the antioxidant activity of an indole library：cyclic voltammetry versus ROS scavenging activity［J］.Tetrahedron Letters，2001，52：101－106.

［8］李亞新，周鑫，趙義.A2／O工藝各段對焦化廢水中難降解有機物的去除作用［J］.中國給水排水，2007，23（14）：4－7.

［9］Camarero S，Ibarra D，Martinez A T，et al.Paper pulp delignification using laccase and natural mediators［J］.Enzyme and Microbial Technology，2007，40（5）：1264－1271.

［10］Calcaterra A，Galli C，Gentili P.Phenolic compounds as likely natural mediators of laccase：a mechanistic assessment［J］.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2008，51：118－120.

［11］Díaz－González M，Vidal T，Tzanov T.Phenolic compounds as enhancers in enzymatic and electrochemical oxidation of veratryl alcohol and lignins［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2011，89（6）：1693－1700.

［12］González K A，Arévalo M C，F(xiàn)alcón M A.Catalytic efficiency of natural and synthetic compounds used as laccase－mediators in oxidising veratryl alcohol and a kraft lignin，estimated by electrochemical analysis［J］.Electrochimica Acta，2009，54：2621－2629.

［13］李詠梅，顧國維，趙建夫.焦化廢水中幾種含氮雜環(huán)化合物缺氧降解機理［J］.同濟大學學報，2001，29（6）：720－723.

［14］Zotti G，Zecchin S，Schiavon.Structure of polyindoles from anodic coupling of indoles：an electrochemical approach［J］.Chemistry of Materials，1994，6：1742－1748.

［15］Michaela D S，Simona G，Roland L.Preparation of immobilized trametes pubescens laccase on a cryogel－type polymeric carrier and application of the biocatalyst to apple juice phenolic compounds oxidation［J］.European Food Research and Technology，2012，234：655－662.

［16］Hu M R，Chao Y P，Zhang G Q.Laccase－mediator system in the decolorization of different types of recalcitrant dyes［J］.Journal of Industrial Microbiology ＆ Biotechnology，2009，36：45－51.

［17］劉友勛，顏克亮，熊征，等.漆酶介體系統(tǒng)對孔雀綠的脫色研究［J］.環(huán)境科學與技術(shù)，2008，31（7）：37－39.