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      索拉非尼對(duì)敏感人肝癌細(xì)胞株MAPK信號(hào)通路基因表達(dá)的影響*

      2013-11-07 06:02:46殷曉煜肖偉鍇梁力建
      中國(guó)病理生理雜志 2013年1期
      關(guān)鍵詞:索拉非尼細(xì)胞株激酶

      陳 東, 趙 鵬, 殷曉煜, 陳 偉, 肖偉鍇, 梁力建△

      索拉非尼(sorafenib;商品名:多吉美)是一個(gè)多靶點(diǎn)的分子靶向藥物,對(duì)受體輔助因子1(receptor accessory factor,Raf-1)激酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor,VEGFR)2、VEGFR3、Fms樣酪氨酸激酶(Fms-like tyrosine kinase,F(xiàn)LT)3、Ret、C-kit、血小板源性生長(zhǎng)因子受體(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)等靶點(diǎn)有抑制作用。目前已有多項(xiàng)國(guó)際多中心研究證明索拉非尼對(duì)晚期原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)有明顯、確切的療效,能明顯延長(zhǎng)晚期肝癌的生存時(shí)間[1-4]。目前,索拉非尼已作為晚期、不可切除肝癌的標(biāo)準(zhǔn)治療而廣泛應(yīng)用。Liu等[5]利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)索拉非尼可抑制Raf,下調(diào)絲裂原激活蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MAPKK,又稱MEK)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)表達(dá),即通過抑制Raf/MEK/ERK(MAPK)信號(hào)通路的表達(dá)來抑制HCC細(xì)胞的增殖。另外,絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路也是VEGFR2、VEGFR3、PDGFR等靶點(diǎn)的下游信號(hào)通路,但索拉非尼抑制MAPK信號(hào)通路的具體分子機(jī)制目前仍不明確。本研究進(jìn)行完善的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和CCK-8(cell counting kit-8)實(shí)驗(yàn),篩選出對(duì)索拉非尼敏感的肝癌細(xì)胞株,利用MAPK信號(hào)通路PCR基因芯片,檢測(cè)索拉非尼作用后MAPK信號(hào)通路中具體分子的基因表達(dá)變化,確定了索拉非尼作用HCC過程中MAPK信號(hào)通路中發(fā)生變化的具體作用分子。

      材料和方法

      1 材料

      1.1 細(xì)胞株 Huh7、HepG2、SMCC7721和 PLC 細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫,HepG2.2.15細(xì)胞購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司,MHCC-97H細(xì)胞購(gòu)自上海中山醫(yī)院肝癌研究所。

      1.2 基因芯片 人 MAPK PCR Array(PAHS-061,Qiangen)。

      1.3 儀器與試劑 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱(QUEUE),流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson),紫外吸收分光光度計(jì)(NanaDrop? ND-1000),DMEM培養(yǎng)基(Gibco),胎牛血清(Gibco),二甲基亞砜(DMSO,上海生物試劑廠),EDTA(華美生物工程公司);青/鏈霉素雙抗(penicillin-streptomycin,P/S,上海新先鋒藥業(yè)有限公司),CCK-8試劑盒(Sigma),sorafenib(德國(guó)拜耳醫(yī)藥公司),Annexin-PE/7-AAD凋亡檢測(cè)試劑盒(Becton&Dickinson),Trizol試劑(Invitrogen),RNeasy? MinEluteTM純化試劑盒(Qiagen),2× SuperArray PCR master Mix(Cat.No.PA-112)。

      2 方法

      2.1 敏感肝癌細(xì)胞株的篩選

      2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將各HCC細(xì)胞株接種在含10%小牛血清,1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)良好呈單層貼壁生長(zhǎng),48~72 h換液1次。傳代時(shí)用0.1%胰蛋白酶消化。

      2.1.2 索拉非尼藥物配制 用手術(shù)刀片將索拉非尼藥片糖衣輕輕刮去,刮凈糖衣,在稱量紙上將藥片研成粉末狀,稱重后將粉末倒入試管中,加入適量DMSO液,配制成濃度為100 μmol/L的索拉非尼工作液,-20℃保存。

      2.1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 每種細(xì)胞株設(shè)對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組;細(xì)胞株用不含EDTA的胰酶消化;將濃度為2×108/L呈指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞懸液接種于6孔板,每孔2.5 mL(即 5 ×105cells/well),孵育 24 h;對(duì)照組每孔加入0.5 mL DMSO,實(shí)驗(yàn)組每孔加入索拉非尼0.5 mL 溶液(終濃度為 4 μmol/L),每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔,孵育72 h;收集、離心,PBS液洗滌,重懸細(xì)胞,加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL propidium iodide(PI),混勻,室溫避光反應(yīng)10 min,在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

      2.1.4 CCK-8法檢測(cè) 每種細(xì)胞設(shè)空白組(培養(yǎng)液+CCK-8)、對(duì)照組(細(xì)胞+培養(yǎng)液+CCK-8)、實(shí)驗(yàn)組(細(xì)胞+培養(yǎng)液+索拉非尼+CCK-8);取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Huh7、MHCC97、HepG2 、SMCC7721 和HepG2.2.15細(xì)胞,胰酶消化制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整濃度為5×107/L,96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液;各組設(shè)4個(gè)不同索拉非尼作用濃度,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔;5%CO2、37℃孵育,吸凈培養(yǎng)液,加入無血清的DMEM液“饑餓細(xì)胞”24 h;吸凈培養(yǎng)液,對(duì)照組加入培養(yǎng)液200 μL,實(shí)驗(yàn)組內(nèi)加入不同量的索拉非尼溶液,余量液體用培養(yǎng)液補(bǔ)足,每孔液體量200 μL,孵育24 h;加入10 μL CCK-8溶液,孵育2 h,酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)比色測(cè)定每孔吸光度(A)值,記錄結(jié)果;細(xì)胞存活率(%)=(Aa-Ab)/(Ac-Ab)×100%;a:實(shí)驗(yàn)孔;b:空白孔;c:對(duì)照孔。

      2.2 索拉非尼對(duì)敏感肝癌細(xì)胞株MAPK信號(hào)通路基因表達(dá)譜的影響

      2.2.1 選擇上述實(shí)驗(yàn)所篩選的敏感肝癌細(xì)胞株P(guān)LC細(xì)胞。

      2.2.2 細(xì)胞分組 在3.5 cm直徑的培養(yǎng)盤中培養(yǎng),分2組:PLC對(duì)照組(Pc組)和PLC+索拉非尼組(Pt組)。細(xì)胞貼壁后,Pc組加入DMSO液,Pt組加入索拉非尼,用藥濃度為5.25 μmol/L,加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)盤中直接中加入1 mL Trizol試劑裂解細(xì)胞,裂解時(shí)用槍吸打幾次,然后分別放-80℃保存。置于干冰中運(yùn)送至上??党缮锕具M(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

      2.2.3 PCR array操作 (1)RNA抽提:劇烈振蕩經(jīng)Trizol裂解后樣本15 s,15~30℃孵育2~3 min。4℃下12 000×g離心15 min,將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA,勻漿時(shí)加入1 mL Trizol試劑的同時(shí)加0.5 mL的異丙醇。混勻后15~30℃孵育10 min,4℃ 12 000×g離心10 min。移去上清液,加入75%乙醇,清洗RNA沉淀。振蕩后,4℃ 7 500×g離心5 min。去除乙醇溶液,干燥RNA沉淀5~10 min,溶解RNA,55~60℃孵育10 min,保存于-70℃。(2)cDNA合成:按試劑盒操作說明,每個(gè)純化柱的中心加入50 μL無RNA酶的H2O,放置2 min后8 000×g離心1 min,得到的溶液即純化的cRNA,暫時(shí)保存于冰中。(3)實(shí)時(shí)定量PCR:小心打開PCR array上的膜,加10 μL混合液到PCR array對(duì)應(yīng)的每個(gè)孔中,小心蓋上蓋子密封PCR array,置于PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。

      2.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用ΔΔCt方法:(1)計(jì)算每個(gè)處理組中的每個(gè)通路相關(guān)基因的ΔCt:ΔCt(group 1)=average Ct- average of HK genes’Ct for group array;(2)計(jì)算2個(gè)PCR array(或2組)中每個(gè)基因的ΔΔCt:ΔΔCt= ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對(duì)照組);(3)通過2-ΔΔCt計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)差異。

      3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,均數(shù)比較用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      結(jié) 果

      1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝癌細(xì)胞株凋亡

      Huh7、MHCC97H、HepG2 、SMCC7721、HepG2.2.15和PLC肝癌細(xì)胞株經(jīng)索拉非尼作用后,細(xì)胞凋亡均較對(duì)照組明顯增加(P<0.05),見圖1。從凋亡細(xì)胞百分比可以看出,對(duì)索拉非尼較敏感細(xì)胞株為PLC細(xì)胞和 HepG2.2.15細(xì)胞(P < 0.01),對(duì)其相對(duì)不敏感細(xì)胞株為SMCC7721細(xì)胞和MHCC97H細(xì)胞,見圖2。

      2 索拉非尼對(duì)各肝癌細(xì)胞株存活率的影響

      由各細(xì)胞系的IC50值可看出,對(duì)索拉非尼相對(duì)敏感細(xì)胞株為PLC細(xì)胞,不敏感細(xì)胞株為SMCC7721細(xì)胞,見圖3。

      3 MAPK PCR array實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組MAPK信號(hào)通路中有8個(gè)差異表達(dá)基因,其中>2.0倍有2個(gè),≤0.5倍有6個(gè)。其中,細(xì)胞周期蛋白E1(cyclin E1,CCNE1)、周期素依賴性激酶 6(cyclin-dependent kinase 6,CDK6)和周期素依賴性激酶抑制因子1C(cyclin-dependent kinase inhibitor 1C,CDKN1C)與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)相關(guān);jun原癌基因(jun proto-oncogene)、CREB結(jié)合蛋白(CREB-binding protein,CREBBP)、MAP 激酶相互作用絲/蘇氨酸激酶1(MAP kinase-interacting serine/threonine kinase-1,MKNK1)和MAP激酶激活的蛋白激酶3(MAP kinase-activated protein kinase 3,MAPKAPK3)與轉(zhuǎn)錄因子的活化有關(guān),見表1。

      討 論

      本研究以索拉非尼作用不同肝癌細(xì)胞株Huh7、MHCC97H、HepG2、SMCC7721、HepG2.2.15 和 PLC,然后通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),索拉非尼實(shí)驗(yàn)組對(duì)上述各種肝癌細(xì)胞的促凋亡作用均明顯強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.05)。用不同濃度的索拉非尼作用于這些細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞不同其IC50值有差異,通過流式細(xì)胞術(shù)和CCK-8實(shí)驗(yàn),篩選出對(duì)索拉非尼敏感細(xì)胞株和不敏感細(xì)胞株分別為PLC和SMCC7721。篩選索拉非尼敏感和不敏感肝癌細(xì)胞株對(duì)于后續(xù)索拉非尼相關(guān)基礎(chǔ)研究有重要意義,可供同行參考。

      研究表明,基因和蛋白質(zhì)較少單獨(dú)起作用,它們往往通過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)交互作用共同影響生物系統(tǒng)的功能。索拉非尼作用于肝癌涉及的信號(hào)通路尚包括STAT3[6]、PI3k/Akt/mTOR 信號(hào)通路等[7]。由于索拉非尼主要通過抑制Raf-1抑制MAPK信號(hào)通路,MAPK信號(hào)通路同時(shí)也是索拉非尼設(shè)計(jì)的其它作用靶點(diǎn)如VEGFR2、VEGFR3、PDGFR等分子下游的主要信號(hào)通路,因此,本研究重點(diǎn)深入研究MAPK信號(hào)通路具體分子基因的表達(dá)變化。

      Figure 1.Cell apoptosis determined by flow cytometry.PLC,SMMC7221,HepG2.2.15,Huh7,HepG2 and MHCC97H cells were exposed to sorafenib for 72 h,then 5 μL Annexin V-FITC and 5 μL propidium iodide(PI)were added for 10 min of incubation.圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

      Figure 2.Apoptotic rates determined by flow cytometry.Mean ±SD.n=3.△P < 0.05,△△P < 0.01 vs control group.圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞百分比

      Figure 3.Survival rates of different hepatocarcinoma cell lines treated with sorafenib(2.5,5,15 and 20 μmol/L)for 24 h were determined by CCK-8 assay.Mean ±SD.n=3.The IC50 values of sorafenib were 5.25 μmol/L for PLC cells,5.30 μmol/L for HepG2.2.15 cells;6.80 μmol/L for Huh7 cells,7.01 μmol/L for HepG2 cells,11.7 μmol/L for MHCC97H cells and 15.0 μmol/L for SMCC7721 cells.圖3 索拉非尼作用后各肝癌細(xì)胞株的存活率

      MAPK信號(hào)通路PCR芯片包含了與MAPK信息轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)的全部84種基因。實(shí)驗(yàn)組MAPK信號(hào)通路中有8個(gè)差異表達(dá)基因,其中>2.0倍的有2個(gè),≤0.5倍的有6個(gè)。其中,CCNE1、CDK6和 CDKN1C與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)相關(guān);jun、CREBBP、MKNK1和MAPKAPK3與轉(zhuǎn)錄因子的活化有關(guān)。CCNE1基因編碼cyclin E1,CDKN1C編碼p57Kip2。一般而言,cyclin E1和周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)2結(jié)合,成為細(xì)胞從G1進(jìn)入S期的關(guān)鍵激酶復(fù)合物,磷酸化相關(guān)底物蛋白而發(fā)揮作用;而p57Kip2作為抑制因子,可結(jié)合cyclin E1-CDK2使其失去活性[8]。已有報(bào)道,p57Kip2和HCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)系,p57Kip2失活與低分化的HCC密切相關(guān),是HCC預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[9]。本研究發(fā)現(xiàn),索拉非尼作用PLC細(xì)胞株后,CDKN1C(p57)上調(diào),CCNE1(cyclin E1)和CDK6下調(diào),但索拉非尼影響p57-cyclin E1-CDK6細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的具體過程,值得進(jìn)一步研究。由于索拉非尼在應(yīng)用過程中可發(fā)生耐藥,部分患者在應(yīng)用的后期對(duì)索拉非尼失去反應(yīng),腫瘤因此發(fā)生進(jìn)展,導(dǎo)致治療效果下降。因此,目前有提倡聯(lián)合用藥,提高索拉非尼治療HCC的療效的相關(guān)研究[10]。另有研究表明,miR-195在 85.7% 的HCC中顯著下調(diào),而CDK6則是miR-195的一個(gè)作用靶點(diǎn)[11]。索拉非尼有無可能通過miR-195-CDK6機(jī)制抑制HCC細(xì)胞,有待進(jìn)一步研究。目前關(guān)于microRNA、索拉非尼和 HCC三者關(guān)系的研究較少[12-13],而microRNA是未來藥物研究的一個(gè)方向。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為未來的索拉非尼研究提供了相關(guān)的線索。

      本研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼作用后MAPK信號(hào)通路中的jun上調(diào),這與最近Cervello等[14]的研究一致。他們運(yùn)用全基因組芯片,利用索拉非尼作用HepG2細(xì)胞株,同樣發(fā)現(xiàn)jun基因上調(diào);他們的研究還發(fā)現(xiàn),索拉非尼作用后,HRK mRNA和c-Jun顯著上調(diào)且HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡,而HRK正是c-Jun作用的的一個(gè)基因靶點(diǎn),另外抑制c-Jun信號(hào)通路可與索拉非尼發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。本研究所采用的細(xì)胞系和Cervello等[13]的不同,但有相似的結(jié)果,提示本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為可靠,c-Jun上調(diào)可能是索拉非尼抑制HCC細(xì)胞時(shí)發(fā)生的共同現(xiàn)象;同時(shí),也提示在索拉非尼抑制肝癌的研究領(lǐng)域中,有必要進(jìn)一步對(duì)c-Jun信號(hào)通路在其中的具體機(jī)制進(jìn)行研究。

      表1 Sorafenib處理PLC細(xì)胞后MAPK信號(hào)通路的差異表達(dá)基因Table 1.Differential expression of MAPK signal genes in sorafenib-treated PLC cells

      總之,本研究篩選出對(duì)索拉非尼敏感的HCC細(xì)胞系,并利用此敏感細(xì)胞系,通過MAPK信號(hào)通路基因芯片,鑒定出索拉非尼作用后MAPK信號(hào)通路中發(fā)生變化的具體分子,這些分子主要與細(xì)胞周期調(diào)控和轉(zhuǎn)錄因子活化相關(guān),為進(jìn)一步的研究提供了線索和方向。

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