噬菌體治療細(xì)菌感染的研究進(jìn)展

裴景亮，付玉榮 綜述

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)系、附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科、山東省臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊 261031;2.濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，山東 濰坊 261053)

耐藥菌特別是多重耐藥菌的出現(xiàn)對(duì)人類健康構(gòu)成了極大威脅，這類細(xì)菌感染的疾病面臨無(wú)藥可用的境地。尋找新的有效的抗菌制劑已經(jīng)成為刻不容緩的問(wèn)題。噬菌體制劑作為新型的治療方法，受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。

噬菌體(bacteriophage，phage)是一類特異性感染細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物的病毒，廣泛存在于水、土壤、植物、動(dòng)物和人體中，其遺傳物質(zhì)和結(jié)構(gòu)都非常簡(jiǎn)單，必須寄生于細(xì)菌、真菌等宿主體內(nèi)，借助宿主菌的酶系統(tǒng)及其他條件才能進(jìn)行復(fù)制。

1 噬菌體裂解細(xì)菌的機(jī)制與代謝動(dòng)力學(xué)

根據(jù)噬菌體與宿主菌的關(guān)系，一般認(rèn)為烈性噬菌體更適合作為細(xì)菌感染治療的工具。噬菌體在宿主菌體內(nèi)具有自我復(fù)制功能，因此很難構(gòu)建一個(gè)數(shù)學(xué)模型來(lái)揭示噬菌體的代謝動(dòng)力學(xué)，以及采取何種給藥途徑進(jìn)行治療也沒(méi)有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。在體內(nèi)噬菌體發(fā)揮殺菌作用還與機(jī)體的免疫狀況密切相關(guān)。Birendra 等［1］在中性粒細(xì)胞減少的綠膿桿菌感染的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，PA1Φ 不能保護(hù)中性粒細(xì)胞減少的小鼠的綠膿桿菌感染，研究證實(shí):噬菌體與中性粒細(xì)胞聯(lián)合作用會(huì)起到更好的作用。噬菌體控制細(xì)菌感染有2 種方式:被動(dòng)治療與主動(dòng)治療。被動(dòng)治療則指最初的噬菌體劑量足以在數(shù)量上大大超過(guò)細(xì)菌，細(xì)菌一次吸附了大量的噬菌體顆粒，細(xì)菌被裂解。主動(dòng)治療指噬菌體侵染細(xì)菌后在細(xì)菌體內(nèi)增殖再次攻擊細(xì)菌發(fā)揮裂解作用。Birendra 等［1］的實(shí)驗(yàn)證明，噬菌體在體內(nèi)72 h即可被機(jī)體的免疫系統(tǒng)清除，噬菌體的這種動(dòng)力學(xué)特性決定了其給藥途徑與傳統(tǒng)的抗生素截然不同。

噬菌體對(duì)宿主菌的溶解是由噬菌體自身蛋白介導(dǎo)的溶解系統(tǒng)完成的。缺乏溶壁酶的小基因組噬菌體利用多肽在不同階段抑制宿主菌的胞壁質(zhì)合成酶，從而在不同階段溶解宿主菌。目前研究比較清楚的大腸桿菌λ 噬菌體，其裂解基因包括S、R 和RZ3個(gè)基因［2］。R 基因和RZ 基因的產(chǎn)物分別降解細(xì)胞壁的肽聚糖和切割肽聚糖寡糖間的交聯(lián)，而S 基因的產(chǎn)物作用于細(xì)胞膜上形成孔洞，使R 基因和RZ 基因產(chǎn)生的酶到達(dá)細(xì)胞壁，從而降解細(xì)胞壁的肽聚糖。

2 全菌噬菌體制劑治療細(xì)菌感染的應(yīng)用

2.1 全菌治療的應(yīng)用 近幾年，研究人員對(duì)噬菌體的篩選、分離純化、治療前的處理、藥物動(dòng)力學(xué)等進(jìn)行了大量的研究［3］，實(shí)驗(yàn)證明，噬菌體治療細(xì)菌感染具有很高的有效性和安全性，尤其是耐藥菌的感染。耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)的治療是臨床上面臨的棘手的問(wèn)題，Capparelli 等［4］人利用噬菌體來(lái)控制MRSA 的感染，取得了良好的效果，其研究結(jié)果顯示MRSA 的噬菌體在體內(nèi)和體外都可以殺滅巨噬細(xì)胞內(nèi)部的MRSA。噬菌體的指數(shù)增殖能力是噬菌體治療的突出優(yōu)勢(shì)，只需少量的噬菌體就可以完成裂解細(xì)菌的工作。噬菌體具有高度特異性，不會(huì)影響到其他的菌群，不會(huì)破壞體內(nèi)微生態(tài)的平衡、導(dǎo)致其他耐受性致病菌的生長(zhǎng)，也很少引起胃腸道反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)等［5］。Birendra 等［1］觀察了一種新型綠膿桿菌噬菌體PA1Φ 在小鼠綠膿桿菌感染模型中的作用，發(fā)現(xiàn)噬菌體能有效地治療致死劑量的綠膿桿菌引起的感染，小鼠的存活率可達(dá)80%～100%。噬菌體治療小鼠沒(méi)有產(chǎn)生敗血癥任何跡象，而未經(jīng)處理的小鼠表現(xiàn)出垂死的狀態(tài)，最后死于敗血癥。隨后的研究也證實(shí)了PA1Φ 噬菌體在體內(nèi)有很強(qiáng)大的殺菌功效［6-7］。感染肺炎克雷伯菌的燒傷小鼠模型注射噬菌體，可使小鼠成活率達(dá)73.33%［8］，顯著高于常規(guī)藥物治療組。

2.2 全菌的給藥途徑 噬菌體的給藥途徑是目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)，與噬菌體治療的成效密切相關(guān)，目前最常用的是口服和注射兩種途徑。口服噬菌體制劑在治療胃腸道感染時(shí)被認(rèn)為是最有效的給藥方式?？诜笫删w制劑要在胃液的高酸性環(huán)境中保持活性，必須采取一定的措施，有報(bào)道采用聚合物的膠囊可以保護(hù)噬菌體，從而提高療效［9］。Oliveira 等［10］的研究證實(shí)一些口服的噬菌體有被吸收進(jìn)入全身循環(huán)的能力，研究結(jié)果證明某些噬菌體可能不僅駐留在腸腔而且還通過(guò)腸壁，這個(gè)過(guò)程類似于細(xì)菌的移位定值，這個(gè)過(guò)程可能與噬菌體的濃度、噬菌體與腸道免疫細(xì)胞的相互作用、噬菌體的特定序列有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，注射是一個(gè)最常用也最成功的噬菌體治療給藥途徑，因?yàn)槭删w能迅速分布到全身，迅速到達(dá)感染部位。然而最近的研究表明，不同的注射方式，如肌肉注射、皮下注射、腹腔內(nèi)注射療效卻不一致，但都表明噬菌體的濃度越大，其抗菌效果越好［11-13］。霧化吸入噬菌體用于肺部細(xì)菌感染是現(xiàn)在的一個(gè)重要突破，有研究證實(shí)噬菌體制成干粉后在4℃～22℃的情況下可保持穩(wěn)定性達(dá)三個(gè)月，可以作為治療肺部細(xì)菌感染的一個(gè)重要方式［14-15］。另外噬菌體制劑局部外用以及醫(yī)療設(shè)備的殺菌都有成功的例子［16-18］。

2.3 全菌治療遇到的問(wèn)題 活噬菌體制劑宿主特異性太強(qiáng)，宿主譜太窄是目前的主要問(wèn)題。自然分離的噬菌體都具有高度專一的宿主選擇性，往往只能感染單一的細(xì)菌分離株，為了解決這一問(wèn)題，有研究采用雞尾酒療法，不同菌株的噬菌體混在一起，拓寬噬菌體的裂解譜，結(jié)果表明混合噬菌體在很多時(shí)候優(yōu)于單一的噬菌體制劑［19-20］。利用分子生物學(xué)技術(shù)，拓展噬菌體的宿主譜，為噬菌體制劑的應(yīng)用提供了一個(gè)新的思路。Mahichi 等［21］利用同源重組技術(shù)，用寬宿主譜噬菌體IP008 的g37 和g38 替代T2 噬菌體的相應(yīng)基因，得到的重組噬菌體獲得了與IP008 相同的宿主譜，并保持了其裂解活性。這些研究表明，通過(guò)遺傳改造噬菌體的宿主識(shí)別基因可以人為改變噬菌體的宿主譜。

機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)噬菌體的清除也是噬菌體治療中必須解決的一個(gè)重要問(wèn)題。此外，機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)噬菌體的中和抗體，引起噬菌體失活，為了避免出現(xiàn)這一情況，需要找到降低噬菌體免疫原性的方法。

噬菌體會(huì)將某些毒力基因水平轉(zhuǎn)移至細(xì)菌中。對(duì)于那些由噬菌體傳播的毒性基因和耐藥性基因，解決的辦法是選擇合適的噬菌體，避免使用具有轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的噬菌體，以及構(gòu)建遺傳學(xué)突變的噬菌體。噬菌體治療的藥代動(dòng)力學(xué)可能會(huì)比常規(guī)藥物更為復(fù)雜。其機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3 噬菌體裂解酶制劑的應(yīng)用

為了克服活性噬菌體制劑的局限性，人們?cè)O(shè)想提純活性噬菌體的特異性裂解酶作為抗菌制劑治療細(xì)菌感染。這種特異性裂解酶是一類細(xì)胞壁裂解酶類，它與細(xì)菌細(xì)胞壁的糖基特異性結(jié)合，發(fā)揮作用;而這種細(xì)胞壁糖基具有種屬特異性。純化的噬菌體裂解酶可以用于細(xì)菌感染的治療和預(yù)防是Nelson 等2001年證實(shí)的。這種胞壁質(zhì)裂解酶在噬菌體感染革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性細(xì)菌時(shí)發(fā)揮重要作用，研究表明，純化的噬菌體裂解酶Cpl-1 在肺炎鏈球菌引起的心內(nèi)膜炎和細(xì)菌性腦膜炎的試驗(yàn)中，顯示出了良好的抗菌活性［22］。全菌噬菌體和噬菌體裂解酶制劑治療細(xì)菌感染的優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表1。

表1 全菌噬菌體和噬菌體裂解酶制劑治療細(xì)菌感染的優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 The advantages and disadvantages of bacteriophage and lytic enzymes

內(nèi)溶素作為一種裂解酶制劑受到越來(lái)越多的的關(guān)注，Bokyung［23］首次報(bào)道LysB4 噬菌體內(nèi)溶素具有很強(qiáng)的抗菌作用，而且噬菌體內(nèi)溶素具有較寬的抗菌譜，在革蘭陽(yáng)性及革蘭陰性菌種都表現(xiàn)出了抗菌作用;研究還發(fā)現(xiàn)LysB4噬菌體內(nèi)溶素最適pH8.0～10.0，活性需要二價(jià)金屬，特別是Zn 離子的參與。

葡萄球菌屬細(xì)菌引起的感染在人和動(dòng)物都很常見(jiàn)，而且能通過(guò)多種途徑獲得耐藥性，現(xiàn)在治療此類感染變得非常困難。噬菌體編碼的內(nèi)溶素不僅能高效的殺滅耐藥菌而，且在體內(nèi)無(wú)殘留。Hirofumi 等［24］從污水中分離了P-27/HP噬菌體，并純化了其內(nèi)溶素。在SDS-PAGE 電泳中P-27/HP 內(nèi)溶素分為33.5 kDa、48.6 kDa與62.2 kDa 三個(gè)片段。體外實(shí)驗(yàn)證明，在37℃～40℃，pH 為7.0，內(nèi)溶素具有最大殺菌活性;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了P-27/HP 內(nèi)溶素強(qiáng)大的殺菌作用。

有些裂解酶在裂解細(xì)菌細(xì)胞壁時(shí)，因?yàn)槿鄙傩盘?hào)肽而需要Holin 蛋白的協(xié)助。Holin 蛋白是一種疏水性跨膜蛋白，在噬菌體復(fù)制晚期，于宿主菌細(xì)胞膜上形成非特異性的孔洞或損傷，促使細(xì)胞壁水解酶接近它的肽聚糖靶點(diǎn)，以此控制裂解酶在體內(nèi)裂解細(xì)菌的時(shí)間。Holin/裂解酶共同作用的模型在肺炎球菌、金黃色葡萄球菌和乳酸菌中普遍存在［25］。

噬菌體裂解酶作為一種新型抗菌劑與活性噬菌體比較，最大的優(yōu)點(diǎn)就是不能自我復(fù)制，易于定向操作，不產(chǎn)生抗藥性;同時(shí)還具有高效快速、安全性高、基因修飾簡(jiǎn)單、應(yīng)用前景好等優(yōu)點(diǎn)。到目前為止，噬菌體裂解酶還處于實(shí)驗(yàn)室研究和臨床實(shí)驗(yàn)階段，裂解酶細(xì)胞壁識(shí)別位點(diǎn)的分子和基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)了解得很少，而這是了解裂解酶如何降解細(xì)菌外膜的關(guān)鍵。Horgan 等［26］對(duì)裂解素的功能區(qū)域進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)小的功能單位仍具有活性。

與活性噬菌體制劑一樣，噬菌體裂解酶的應(yīng)用同樣受限于其特異性，因此擴(kuò)大噬菌體裂解酶的殺菌譜仍然是一個(gè)需要解決的問(wèn)題。噬菌體裂解酶由兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成，N 端的催化結(jié)構(gòu)域相對(duì)保守，C 端的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域決定其宿主特異性，通過(guò)不同噬菌體裂解酶之間結(jié)構(gòu)域的交換重組可以改變裂解酶的宿主特異性或(和)裂解能力，可以基因工程技術(shù)交換重組裂解酶的不同結(jié)構(gòu)域改變其作用范圍或(和)提高其裂解活性。造成嚴(yán)重臨床感染的很多致病菌是革蘭陰性菌，如何對(duì)噬菌體裂解酶進(jìn)行修飾，使其穿過(guò)外膜裂解肽聚糖，是利用裂解酶控制革蘭陰性菌感染必須要解決的問(wèn)題。使用裂解酶治療細(xì)菌感染時(shí)，酶的耐藥性和機(jī)體對(duì)酶的免疫應(yīng)答反應(yīng)也是目前面臨的問(wèn)題。

4 展 望

多重耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)和蔓延，正使人類面臨無(wú)抗生素可用的危險(xiǎn)境地，迫切需要研究新的抗菌制劑，噬菌體制劑對(duì)此提供了一種新的思路。噬菌體治療細(xì)菌感染特別是多重耐藥菌感染具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，前景廣闊。但噬菌體及其制劑真正廣泛地應(yīng)用于臨床還面臨諸多問(wèn)題，如殺菌譜窄、全菌噬菌體的免疫原性、藥代動(dòng)力學(xué)、給藥途徑與劑量等等。為了噬菌體治療細(xì)菌感染的安全性和有效性，我們需要對(duì)噬菌體在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)做更多的研究;可以利用分子生物學(xué)技術(shù)在分子水平上改造噬菌體，擴(kuò)大其殺菌譜，敲除其毒性基因和耐藥基因，使其應(yīng)用更加廣泛。在近年研究基礎(chǔ)上，有理由堅(jiān)信，使用噬菌體及其裂解酶在抗感染治療方面將會(huì)取得更大的成功。

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