不同處理時(shí)間的靜磁場(chǎng)對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞成熟分化及雌激素受體基因表達(dá)的影響

王嘉琪，馬小妮，周 建，葛寶豐，郭曉宇，陳克明

蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所，蘭州730050

骨代謝是一個(gè)由成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞的骨吸收構(gòu)成的動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程。1987年，Gray等［1］首次在體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了雌激素受體(estrogen receptor，ER)，揭示了雌激素對(duì)成骨細(xì)胞的直接影響。此外，電磁場(chǎng)已被證明能影響機(jī)體骨代謝，并廣泛應(yīng)用于臨床上多種骨骼相關(guān)疾病的預(yù)防和治療［2-3］。自 Yasuda等［4］發(fā)現(xiàn)骨具有壓電效應(yīng)以來(lái)，許多學(xué)者致力于低頻磁場(chǎng)治療骨質(zhì)疏松的理論和實(shí)踐研究，但尚未見(jiàn)有關(guān)電磁場(chǎng)與ER關(guān)系的報(bào)道。本研究以原代培養(yǎng)的大鼠顱骨成骨細(xì)胞為研究對(duì)象，探討不同處理時(shí)間的靜磁場(chǎng) (static magnetic fields，SMFs)對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞ER的影響，以期為SMFs的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

材料和方法

SMFs發(fā)生儀實(shí)驗(yàn)所用SMFs發(fā)生儀由本研究組與蘭州理工大學(xué)共同研制，線圈內(nèi)徑為180 mm，頻率、磁感應(yīng)強(qiáng)度均精確可調(diào)。磁感應(yīng)信號(hào)經(jīng)計(jì)算機(jī)控制程序產(chǎn)生后，經(jīng)過(guò)信號(hào)放大器放大后傳入磁場(chǎng)線圈，基本原理如圖1［5］。經(jīng)中國(guó)人民解放軍蘭州軍區(qū)醫(yī)學(xué)計(jì)量測(cè)試研究站測(cè)定表明，SMFs發(fā)生儀運(yùn)行期間磁場(chǎng)環(huán)境均勻穩(wěn)定 (報(bào)告編號(hào):醫(yī)計(jì)磁字ccqd-2008-01)。儀器經(jīng)紫外線照射消毒后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，由導(dǎo)線與外部控制裝置相連。實(shí)驗(yàn)期間培養(yǎng)箱內(nèi)CO2水平為5%，溫度控制在 (37±0.2)℃，濕度為100%。

大鼠、主要試劑及儀器出生48 h內(nèi)的SPF級(jí)SD大鼠10只 ［甘肅省中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)SCXK(甘)2004-0006-152］;胎牛血清 (fetal bovine serum，F(xiàn)BS，蘭州民海生物公司)，α-MEM培養(yǎng)基、Ⅱ膠原酶 (美國(guó)Gibco公司)，地塞米松、磷酸化抗壞血酸、β-磷酸甘油鈉、胰蛋白酶 (美國(guó)Sigma公司)，噻唑藍(lán) (methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，美國(guó)Sigma公司)，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ、熒光染料、PCR正向引物、PCR反向引物 (大連寶生物公司)，堿性磷酸酶試劑盒 (南京建成生物工程研究所)、茜素紅 (美國(guó)AMRESCO公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 (美國(guó)Thermo Fisher公司)，倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS)，紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) (德國(guó)Heraeus公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

圖1 靜磁場(chǎng)發(fā)生儀圖解Fig 1 Schematic of static electromagnetic fields device

成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)將SD大鼠以75%酒精浸泡窒息后斷頭，無(wú)菌條件下取出頭蓋骨，置入盛有培養(yǎng)基的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，去除骨膜、血管及結(jié)締組織，磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffer saline，PBS)漂洗2次，加入0.25%胰酶于37℃下消化15 min，吸除消化液，再加入0.1% Ⅱ型膠原酶37℃下消化4次，每次20 min，收集并合并消化液，用200目細(xì)胞篩過(guò)濾，過(guò)篩后的消化液離心10 min(1000 r/min，r=11.18 cm)，棄上清液，沉淀用 PBS漂洗后用含有10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基懸浮，吹打均勻后，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×104/ml。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%以上時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳代后待單層細(xì)胞融合率達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行成骨性誘導(dǎo)。

成骨細(xì)胞鑒定將傳代后的成骨細(xì)胞接種于35 mm的中皿，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別進(jìn)行堿性磷酸酶染色和鈣化結(jié)節(jié)染色。堿性磷酸酶染色方法參考文獻(xiàn)［6］，磁場(chǎng)暴露處理至第8 d時(shí)進(jìn)行偶氮偶合染色，待出現(xiàn)紫色斑點(diǎn)后停止染色，觀察并照相記錄結(jié)果。茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色方法參考文獻(xiàn) ［6］，磁場(chǎng)處理至第12 d，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗兩次，加入10%福爾馬林固定10 min，棄固定液，加入pH 8.9、0.1%的茜素紅染色液，37℃水浴1 h，流水沖洗，換固定液，照相記錄結(jié)果。

細(xì)胞分組與磁場(chǎng)處理將第1代傳代細(xì)胞 (passage 1，P1)分為9組，每組3個(gè)重復(fù)，用磁場(chǎng)強(qiáng)度為3.9 mT的SMFs分別處理0(對(duì)照組)、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 h。磁場(chǎng)中使用電子測(cè)溫計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)電磁場(chǎng)線圈中的溫度，使其始終保持在 (37±0.2)℃，排除熱效應(yīng)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響。

細(xì)胞增殖分析將P1代細(xì)胞以3×104/ml接種于60 mm培養(yǎng)皿，24 h后每組分別用SMFs處理，對(duì)照組不用磁場(chǎng)處理。48 h后棄培養(yǎng)液，換為含10%MTT的無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)液，加入DMSO搖床震蕩10 min，待紫色結(jié)晶沉淀徹底溶解后，于酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm處的光密度 (optical density，OD)值。

骨鈣素含量的測(cè)定成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后每3 d換液1次，每次換液時(shí)留取1 ml舊培養(yǎng)液，于-20℃保存，待SMFs處理后各時(shí)間點(diǎn)的樣品收集齊全后，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)SMFs處理第3、6、9、12天的骨鈣素分泌量，以μg/孔表示。

逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR分析分別在成骨性誘導(dǎo)培養(yǎng)0、24、48和72 h時(shí)提取總RNA，檢測(cè)ERα和ERβ的mRNA表達(dá)水平。所用引物均委托寶生物 (大連)公司根據(jù)GenBank所發(fā)布的序列設(shè)計(jì)并合成(表1)，總RNA的提取采用TRIzol，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度，并用1%甲醛變性瓊脂糖電泳檢測(cè)其完整性。調(diào)整總RNA的濃度至50 mg/L，取2μl進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄體系包括5×緩沖液4 μl，酶混合物1 μl，50 μmol/L 寡核苷酸引物 1 μL，100 μmol/L 隨機(jī)引物1 μL，總 RNA 2 μl，用 RNA 無(wú)酶水定容至20 μl?；靹蚝箅x心 30 s(3000 r/min，r=6.7 cm)，37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 5 min，取出置于-20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系為 20 μl，包括:SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ (2 × )10 μl、10 μmol/L 正向引物 0.8 μl、10 μmol/L 反向引物 0.8 μl、50 × 染液0.4 μl、模版 cDNA 2 μl、蒸餾水 6 μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火31 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的延伸末收集熒光信號(hào)。隨后緩慢升溫，95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，溫度變化速度為0.1℃/s，進(jìn)行PCR反應(yīng)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)內(nèi)參校正，得到目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析檢驗(yàn)各組間是否有顯著性差異，當(dāng)存在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異時(shí)，采用多參數(shù)單因素方差分析檢驗(yàn)各均數(shù)間差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

成骨細(xì)胞鑒定結(jié)果培養(yǎng)之初細(xì)胞呈三角形、紡錘形或多角形，48 h后數(shù)量明顯增加，體積增大，3～4 d細(xì)胞有克隆形態(tài) (圖2A)。細(xì)胞培養(yǎng)8 d后堿性磷酸酶組織化學(xué)染色鑒定呈陽(yáng)性 (圖2 B);細(xì)胞培養(yǎng)12 d后茜素紅染色鑒定呈陽(yáng)性 (圖2 C)。

表1 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR的引物序列Table 1 The primer sequences of reverse transcription-real time polymerase chain reaction

圖2 成骨細(xì)胞形態(tài) (×100)Fig 2 Characterization of osteoblasts(×100)

對(duì)細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組比較，SMFs處理2.0 h組和3.0 h組的細(xì)胞增殖顯著增加 (P＜0.05)，2.5 h組的細(xì)胞增殖增加也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，其他各組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (表2)。

對(duì)骨鈣素的影響各組骨鈣素的含量第3～9天呈升高趨勢(shì)，第12天略有下降。SMFs處理第3天時(shí)，2.5 h組的骨鈣素含量顯著高于1.5 h組 (P＜0.05)。SMFs處理第6天時(shí)，1.0 h組骨鈣素含量顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)，1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h組也顯著高于對(duì)照組 (P＜0.01)，2.5 h組骨鈣素含量顯著高于 0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、3.5 h和4.0 h組 (P＜0.05)。SMFs處理第9天時(shí)，1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h組骨鈣素含量顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)，2.5 h組骨鈣素含量顯著高于0.5、1.0和3.0 h組 (P＜0.01)。SMFs處理第12天時(shí)，2.5 h組骨鈣素含量顯著高于對(duì)照組、1.5 h組和4.0 h組 (P＜0.05)(圖3)。

表2 磁場(chǎng)處理48 h后細(xì)胞增殖結(jié)果 (±s)Table 2 MTT test results after 48h of SMFs treatment(±s)

表2 磁場(chǎng)處理48 h后細(xì)胞增殖結(jié)果 (±s)Table 2 MTT test results after 48h of SMFs treatment(±s)

OD490:490 nm吸光值OD490:optical density value at 490 nm

組別Group樣本含量Sample number OD490P 0 h 3 2.369±0.0640 —0.5 h 3 2.367±0.1111 0.9789 1.0 h 3 2.304±0.0461 0.3536 1.5 h 3 2.287±0.1974 0.4902 2.0 h 3 2.432±0.0519 0.0221 2.5 h 3 2.591±0.0419 0.0084 3.0 h 3 2.463±0.0960 0.0387 3.5 h 3 2.333±0.3581 0.8675 4.0 h 3 2.507±0.1268 0.0740

圖3 磁場(chǎng)處理后骨鈣素含量的變化Fig 3 The content of osteocalcin in SMFs treated rat osteoblasts

實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果SMFs處理成骨細(xì)胞0 h后，與對(duì)照組比較，1.0 h、2.5 h、3.0 h和3.5 h組的ERα mRNA的表達(dá)水平顯著升高 (P＜0.05)，SMFs處理組之間比較，2.5 h組的ERα mRNA表達(dá)水平顯著高于1.5 h、2.0 h、3.5 h和4.0 h組 (P＜0.05)。SMFs處理 24 h后，0.5 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h和3.5 h組的ERα mRNA表達(dá)量顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05)，2.5 h組的ERα mRNA表達(dá)水平顯著高于0.5 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h和 3.5 h組 (P＜0.01)。SMFs處理 48 h后，1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h組的ERα mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05)，2.5 h組顯著高于0.5 h、2.0 h和3.0 h組 (P＜0.05)。SMFs處理72 h后，1.0 h、1.5 h和2.5 h組ERα mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)，而3.0 h、3.5 h和4.0 h組顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05);2.5 h組的ERα mRNA表達(dá)水平顯著高于其他7個(gè)SMFs處理組 (P＜0.05)(圖4)。

SMFs處理成骨細(xì)胞0 h后，除了2.5 h組 ERβ mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組外 (P＜0.01)，其他各組的ERβ mRNA表達(dá)均受到不同程度的抑制，而2.5 h組的ERβ mRNA表達(dá)水平顯著高于其他SMFs處理組 (4.0 h組除外，P＜0.05)。SMFs處理24 h后，除2.0 h和2.5 h組外，各SMFs處理組的ERβ mRNA表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05)。SMFs處理48 h后，0.5 h、2.5 h和3.5 h組ERβ mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組 (P＜0.01)，1.5 h、2.0 h、3.0 h和4.0 h組的ERβ mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05);2.5 h組ERβ mRNA的表達(dá)顯著低于0.5 h組 (P＜0.01)，而顯著高于1.0 h、2.0 h、3.0 h、3.5 h和4.0 h組 (P＜0.05)。SMFs處理72 h后，各SMFs處理組的ERβ mRNA表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組組 (P＜0.05);2.5 h組的ERβ mRNA表達(dá)水平顯著低于0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.5h和4.0 h組 (P＜0.05)(圖5)。

討 論

成骨細(xì)胞是骨中占主導(dǎo)地位的細(xì)胞，是機(jī)械和電刺激通過(guò)連接間隙傳送信號(hào)的基本條件［7］，也是骨發(fā)生和骨形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，在骨組織的更新活動(dòng)中是最重要的功能細(xì)胞。電磁場(chǎng)具有促成骨效應(yīng)，臨床上已被用于緩解骨質(zhì)疏松癥狀，促進(jìn)骨折愈合，治療骨不連、骨移植、骨壞死等［8］。有大量證據(jù)表明骨再生與雌激素樣作用有著不可分割的聯(lián)系［9-10］，但有關(guān)SMFs不同處理時(shí)間對(duì)成骨細(xì)胞ER的影響仍存在爭(zhēng)議。本研究觀察了強(qiáng)度為3.9 mT、處理時(shí)間分別為 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h的SMFs對(duì)成骨細(xì)胞成熟分化及雌激素受體ERα和ERβ基因表達(dá)的影響。

圖4 SMFs對(duì)ERα mRNA表達(dá)水平的影響Fig 4 Effect of SMFs on ERα mRNA expression in SMFs-treated rat osteoblasts

圖5 SMFs對(duì)ERβ mRNA表達(dá)水平的影響Fig 5 Effect of SMFs on ERβ mRNA expression in SMFs-treated rat osteoblasts

細(xì)胞增殖是生物最根本、最基礎(chǔ)的生命活動(dòng)，是個(gè)體生長(zhǎng)和生命延續(xù)的基本保障。外界的刺激會(huì)使細(xì)胞周期發(fā)生變化，影響細(xì)胞增殖，而成骨細(xì)胞的增殖對(duì)于骨缺損、骨不連等骨病非常重要［11］。Kotani等［12］將大鼠成骨細(xì)胞MC3T3-El暴露于8 T強(qiáng)靜磁場(chǎng)60 h，結(jié)果顯示高強(qiáng)度磁場(chǎng)能通過(guò)增強(qiáng)堿性磷酸酶的活性來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，但對(duì)成骨細(xì)胞的增殖并無(wú)明顯影響。與此結(jié)果不同，本研究發(fā)現(xiàn)，SMFs處理成骨細(xì)胞2.0、2.5、3.0 h時(shí)，可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖。

由成骨細(xì)胞分泌的骨鈣素被認(rèn)為是評(píng)價(jià)成骨功能的特異指標(biāo)，直接反映成骨細(xì)胞的活性和骨生理代謝變化［13］，骨鈣素可能參與調(diào)節(jié)鈣代謝，在骨組織發(fā)育中發(fā)揮鈣化作用，促進(jìn)骨基質(zhì)成熟，在骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用受到較多關(guān)注。本研究結(jié)果表明，SMFs的處理時(shí)間對(duì)成骨細(xì)胞的骨鈣素含量有一定影響，其中SMFs處理2.5 h時(shí)骨鈣素含量的變化最為明顯。

雌激素通過(guò)與成骨細(xì)胞上的ER特異性結(jié)合，能直接增強(qiáng)成骨細(xì)胞功能，從而促進(jìn)骨形成，調(diào)節(jié)雌激素與骨吸收、骨形成之間的關(guān)系，從而對(duì)骨代謝及骨重建起到重要的調(diào)控作用，因此ER是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵物質(zhì)［14］。楊永紅等［15］認(rèn)為低頻脈沖電磁場(chǎng)對(duì)骨質(zhì)疏松的預(yù)防性治療作用機(jī)理不是通過(guò)提高雌激素水平途徑實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果表明，SMFs的處理時(shí)間對(duì)成骨細(xì)胞ERα和ERβ的基因表達(dá)有一定的影響。在SMFs處理成骨細(xì)胞0 h時(shí)，1.0 h、2.5 h、3.0 h和3.5 h組 ERα mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組;處理72 h時(shí)，1.0 h、1.5 h和2.5 h組ERα mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。與之相反，SMFs處理 0 h時(shí)，0.5 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h、3.5 h和4.0 h組ERβ mRNA表達(dá)量顯著低于對(duì)照組;處理72 h時(shí)，所有磁場(chǎng)處理組ERβ mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組。這一結(jié)果提示ERα和ERβ在成骨細(xì)胞中的共同表達(dá)調(diào)控作用，且ERα和ERβ的表達(dá)調(diào)控方向相反。

本研究探討了SMFs對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖、分化及ER基因表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)在采用SMFs處理體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞時(shí)，處理時(shí)間為2.5 h時(shí)的作用效果最為明顯。以本研究結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)一步探索電磁場(chǎng)與ER表達(dá)之間的關(guān)系，有望為磁場(chǎng)治療骨質(zhì)疏松癥提供細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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