姚志華，苑亞?wèn)|，劉艷艷，郭宏強(qiáng)，趙 燕，姚書(shū)娜，楊樹(shù)軍

1鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，鄭州450008

2武警河南總隊(duì)醫(yī)院神經(jīng)外科，鄭州450052

肝癌是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在全球惡性腫瘤中居第5位，嚴(yán)重危害人類生命健康。研究表明，環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)的過(guò)表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而COX-2抑制劑對(duì)多種腫瘤均有較強(qiáng)的抑制作用，且與其他常規(guī)化療藥物聯(lián)用具有協(xié)同作用［1］。本研究采用選擇性COX-2抑制劑塞來(lái)昔布與氟嘧啶類抗腫瘤藥物卡培他濱聯(lián)合用于H22肝癌細(xì)胞移植瘤小鼠，觀察腫瘤抑制作用并探討其作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材料和方法

材料人肝癌H22細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(37℃、5%CO2)，采用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。BALB/c裸鼠，清潔級(jí)，體重 (20±2)g，雌雄各半，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SYXK(豫)2005-0012。塞來(lái)昔布膠囊 (西樂(lè)葆)購(gòu)自美國(guó)輝瑞公司，卡培他濱 (希羅達(dá))購(gòu)自上海羅氏公司，小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗小鼠COX-2、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)p65 和β-actin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自上?？党缮锟萍加邢薰荆琓rizol試劑購(gòu)自美國(guó)Introvigen公司，PCR試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司。

小鼠皮下移植瘤模型無(wú)菌環(huán)境下，吸取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，無(wú)菌生理鹽水調(diào)整至細(xì)胞濃度為1×107/ml，接種于BALB/c小鼠右前肢腋窩皮下，每只小鼠的接種量為0.2 ml，制備小鼠H22移植瘤模型。

動(dòng)物分組及給藥40只模型小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、塞來(lái)昔布組、卡培他濱組和聯(lián)合干預(yù)組4組，每組10只。塞來(lái)昔布以100 mg/kg灌胃［2］，卡培他濱以755 mg/kg(相當(dāng)于最大耐受量2.1 mmol/kg)灌胃［3］，聯(lián)合干預(yù)組同時(shí)給予塞來(lái)昔布和卡培他濱，給藥劑量及途徑與單獨(dú)用藥組相同。對(duì)照組灌胃等量生理鹽水。從接種后第3天起，每天給藥1次，連續(xù)15 d。

指標(biāo)檢測(cè)末次給藥24 h后，脫頸處死小鼠，剝離完整腫瘤組織，生理鹽水漂洗干凈，吸水紙吸干水分后于電子天平稱重，記錄腫瘤重量 (瘤重)并計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/對(duì)照組瘤重×100%。采用熒光定量PCR和Western blotting分別檢測(cè)瘤組織中NF-κB p65和COX-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平。

熒光定量PCR取新鮮瘤組織，采用Trizol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用熒光定量PCR方法檢測(cè) NF-κB p65和 COX-2的 mRNA表達(dá)水平。NF-κB p65 上游引物:5’-ACCCCTTTCAAGTTCCCATAGA-3’，下游引物:5’-ACCTCAATGTCTTCTTTCTGCAC-3’;COX-2 上游引物:5’-GTCTGATGATGTATGCCACAATCTG-3’，下游引物:5’-GATGCCAGTGATAGAGG GTGTTAAA-3’;內(nèi)參 β-actin 上游引物:5’-TGTGCCCATCTACGAGGGGTATGC-3’，下游引物:5’-GGTA CATGGTGGTGCCGCCAGACA-3’。引物由生興生物技術(shù)(南京)有限公司合成。采用 2-ΔΔCT法分析結(jié)果［4］。

Western blotting取瘤組織約100 mg，加入10倍體積的RIPA組織蛋白裂解液，勻漿機(jī)勻漿后，于12 000×g離心20 min，吸取上清液，棄沉淀。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白含量?？偟鞍?(約50 μg)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉于室溫下封閉2 h，分別加入兔抗小鼠NF-κB p65和COX-2的一抗，按照體積比1∶1000稀釋，4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫下孵育4 h，TBST漂洗3次，每次5 min。采用ECL法顯影并壓片。采用Quantity One v4.62軟件分析條帶灰度值，結(jié)果以目的條帶與內(nèi)參β-actin的相對(duì)灰度值表示。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

對(duì)抑瘤率的影響塞來(lái)昔布和卡培他濱組的平均瘤重均較對(duì)照組顯著降低 (P＜0.01，P＜0.001)，兩組抑瘤率分別為30.2%和49.9%。聯(lián)合干預(yù)組的抑瘤率高達(dá)75.4%，平均瘤重明顯低于塞來(lái)昔布組和卡培他濱組 (P＜0.01，P＜0.05)(表1)。

對(duì)NF-κB和COX-2的mRNA表達(dá)的影響NF-κB p65的mRNA表達(dá)水平在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。塞來(lái)昔布和聯(lián)合干預(yù)組顯著抑制了COX-2的mRNA表達(dá)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均＜0.001)，卡培他濱對(duì)COX-2的mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響 (圖1)。

對(duì)NF-κB p65和COX-2蛋白表達(dá)的影響塞來(lái)昔布組和聯(lián)合干預(yù)組NF-κB和COX-2的蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著下降 (P＜0.05);卡培他濱亦可減少NF-κB和COX-2的表達(dá)，但與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(圖2)。

表1 塞來(lái)昔布和卡培他濱對(duì)抑瘤率的影響 (n=10)Table 1 Effects of celecoxib and capecitabine on tumor inhibition rate(n=10)

圖1 塞來(lái)昔布和卡培他濱對(duì)NF-κB p65和COX-2的mRNA表達(dá)的影響Fig 1 Effects of celecoxib and capecitabine on mRNA expression of NF-κB p65 and COX-2

圖2 塞來(lái)昔布和卡培他濱對(duì)NF-κB p65和COX-2蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Effects of celecoxib and capecitabine on protein expression of NF-κB p65 and COX-2

討 論

COX-2是催化花生四烯酸合成前列腺素的關(guān)鍵限速酶，眾多研究表明，COX-2在多種癌組織中高度表達(dá)［5］，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。COX-2抑制劑塞來(lái)昔布具有廣泛的抗腫瘤效應(yīng)［6-7］，臨床研究顯示，塞來(lái)昔布與5-氟尿嘧啶聯(lián)合用于治療多耐藥性肝細(xì)胞癌可顯著增強(qiáng)抑瘤效果［8］，提示塞來(lái)昔布用于聯(lián)合化療具有巨大的應(yīng)用前景?？ㄅ嗨麨I是一種新型的抗腫瘤藥物，在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶后發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，臨床常用于治療乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、食管癌等，近來(lái)發(fā)現(xiàn)卡培他濱對(duì)肝癌亦有良好的治療作用［9］。既往研究表明，卡培他濱與塞來(lái)昔布聯(lián)合化療晚期結(jié)直腸癌可有效控制疾病進(jìn)展并減輕不良反應(yīng)［10］，但兩藥聯(lián)合用于肝癌則鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，塞來(lái)昔布和卡培他濱兩藥單用均可抑制肝癌H22小鼠瘤組織的生長(zhǎng)，抑瘤率分別為30.2%和49.9%，而聯(lián)合干預(yù)組抑瘤率高達(dá)75.4%，療效顯著優(yōu)于單藥治療，提示塞來(lái)昔布和卡培他濱兩藥聯(lián)用治療肝癌H22小鼠具有協(xié)同效應(yīng)。

NF-κB是COX-2的重要上游調(diào)節(jié)因子，在炎癥、腫瘤等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。多種致癌因子均可通過(guò)上調(diào)NF-κB的表達(dá)，刺激細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。生理狀況下，NF-κB是由p65和p50兩個(gè)亞基以及抑制性蛋白IκB結(jié)合為三聚體形式存在，當(dāng)被白細(xì)胞介素-1、內(nèi)毒素等激活后，IκB脫離下來(lái)，活化的二聚體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與DNA特定識(shí)別序列結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，刺激腫瘤細(xì)胞大量增殖，其中p65是起關(guān)鍵作用的催化亞基。抑制NF-κB可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布作為COX-2選擇性抑制劑，可抑制人肝癌細(xì)胞 HeG2中 NF-κB和COX-2表達(dá)［11］。本研究結(jié)果表明，塞來(lái)昔布和聯(lián)合干預(yù)組NF-κB p65和COX-2的蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著下降，而卡培他濱組NF-κB p65和COX-2的表達(dá)則無(wú)明顯變化，提示塞來(lái)昔布與卡培他濱具有不同的抗腫瘤機(jī)制，兩藥聯(lián)用可通過(guò)不同的途徑在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面發(fā)揮協(xié)同作用。

綜上，本研究結(jié)果提示，塞來(lái)昔布可通過(guò)抑制NF-κB p65和COX-2的表達(dá)，增強(qiáng)卡培他濱的抗腫瘤效應(yīng)，兩藥聯(lián)用具有良好的協(xié)同增效作用，為臨床治療肝癌提供了理論依據(jù)。

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