吳曉峰，沙龍澤，沙志強(qiáng)，沈 巖，許 琪

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100005

內(nèi)側(cè)顳葉癲癇(mesial temporal lobe epilepsy，MTLE)是最常見(jiàn)的癲癇綜合征之一，約占所有癲癇患者的40%左右［1］，也是最常見(jiàn)的成年人藥物難治性癲癇［2］。海馬硬化是MTLE的標(biāo)志性病理改變，出現(xiàn)率約為70%［3］，大多數(shù)該病患者僅依靠服用傳統(tǒng)抗癲癇藥物難以取得良好的抗癲癇效果，因此患者常需要通過(guò)手術(shù)切除硬化的海馬組織才能夠達(dá)到抑制癲癇發(fā)作的目的。典型的海馬硬化包括CA1與CA3區(qū)神經(jīng)元的大量丟失，齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞散布，并伴隨星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和苔蘚樣纖維出牙［4］。硬化的海馬組織是產(chǎn)生異常癲癇放電的常見(jiàn)病灶，但關(guān)于海馬硬化的具體分子機(jī)制目前尚不清楚，因此探索硬化海馬中潛在致病分子的表達(dá)模式變化對(duì)于探究MTLE的機(jī)制具有提示意義。

生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(growth-associated protein 43，GAP-43)是一種神經(jīng)元特異性的胞膜磷脂蛋白，在神經(jīng)元中廣泛表達(dá)，可促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、神經(jīng)再生及突觸重建［5］。細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)依賴(lài)的蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)介導(dǎo)的GAP-43 41位絲氨酸的磷酸化修飾會(huì)影響GAP-43與鈣調(diào)蛋白 (calmodulin，CaM)結(jié)合的穩(wěn)定性［6-7］，導(dǎo)致CaM的釋放，而后者作為多種酶的激活劑可影響軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)遞質(zhì)釋放。GAP-43作為苔蘚樣纖維出芽的標(biāo)志物之一，以往在多種癲癇動(dòng)物模型的研究中被發(fā)現(xiàn)，伴隨癲癇發(fā)作被點(diǎn)燃后海馬苔蘚纖維出芽的同時(shí)，GAP-43表達(dá)上調(diào)明顯［8］，提示該蛋白可能與MTLE發(fā)病相關(guān)。本研究觀察了癲癇發(fā)生不同時(shí)期GAP-43及其磷酸化形式 (p-GAP-43)在海馬齒狀回中表達(dá)的時(shí)空分布情況，初步探討了該蛋白與內(nèi)側(cè)顳葉癲癇可能的關(guān)系。

材料和方法

材料健康成年C57BL/6雄性小鼠30只 (北京維通利華有限公司)，體重18～25 g，SPF級(jí)、24 h明暗各半條件飼養(yǎng);0.5 μl微量進(jìn)樣器 (Micro liter syringes，上海高鴿工貿(mào)有限公司);10%水合氯醛 (北京協(xié)和醫(yī)院);單臂腦力體定位儀、微型手持式顱鉆(深圳瑞沃德生命科技有限公司);海人酸 (kainic acid，KA)(k0250，中國(guó)Sigma公司)，工作濃度4 mg/ml，注射200 ng(溶于0.5 μl PBS);GAP-43抗體 (8934S，美國(guó)Cell signaling公司);p-GAP-43抗體 (H1111，美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司);兔超敏二步法檢測(cè)試劑盒 (PV-9001，北京中杉金橋公司)。

動(dòng)物模型的建立將成年C57BL/6雄性小鼠分為生理鹽水注射組、注射KA誘導(dǎo)的潛伏期與慢性期MTLE組，以前鹵為坐標(biāo)原點(diǎn)，定位前囟后 (A)2.0 mm、中線旁 (L)1.8 mm、顱骨下 (V)2.3 mm進(jìn)行海馬右側(cè)單側(cè)注射 (急性期模型注射7 ng KA，慢性期模型注射200 ng KA)，注射后分別以行為學(xué)觀察、病理學(xué)和腦電圖檢測(cè)結(jié)果作為指標(biāo)衡量模型建立成功與否。建模常規(guī)步驟如下:(1)麻醉:用10%水合氯醛腹腔注射C57BL/6小鼠，體重為20 g的小鼠注射100 μl，每增重5 g需額外注射20 μl。注射后約10 min小鼠失去肢體運(yùn)動(dòng)能力，且心率正常的可以進(jìn)行下一步手術(shù)操作。(2)固定:麻醉成功后，將小鼠置于立體定位儀上，將門(mén)齒固定于前端門(mén)齒鉗上，雙側(cè)耳桿插入小鼠耳朵從兩側(cè)固定小鼠，同時(shí)調(diào)整雙側(cè)耳桿水平坐標(biāo)，使小鼠在左右方位上處于正中央。調(diào)整門(mén)齒溝平面，使其與耳間線處于一個(gè)平面上，保證小鼠呼吸暢通，心跳節(jié)律正常。(3)暴露頭骨:用解剖剪減去小鼠頭部毛發(fā)，暴露出頭矢狀線旁各1 cm的皮膚，用75%酒精消毒暴露的頭皮。沿矢狀線剪開(kāi)2 cm皮膚，暴露顱骨，可見(jiàn)前鹵點(diǎn)位置，用手術(shù)刀在前鹵點(diǎn)向兩側(cè)刮開(kāi)骨膜約5 mm。(4)定位:把裝有50 nl(PBS中溶有7ng或200ng KA)KA的微量注射器固定于立體定位儀上，使其針尖位于前鹵點(diǎn)后2.0 mm(anteroposterior，AP=2.0 mm)，矢狀線旁向右1.8 mm(mediolateral，ML=1.8 mm)，用彩筆筆尖標(biāo)記。 (5)注射:用手持式電動(dòng)微型顱鉆在標(biāo)記點(diǎn)為開(kāi)顱點(diǎn)鉆孔，不傷害顱骨下的腦組織。將微量注射器緩慢進(jìn)針，深度為2.3 mm(dorsoventral，DV=2.3 mm)。經(jīng)前期注射染料驗(yàn)證，此深度可以將50 nl的液體注射至海馬CA1區(qū)。在2 min內(nèi)將50 nl的藥物完全注射至海馬內(nèi)，注射后留針約2 min以防止注射液倒流，最后緩慢拔出注射器。(6)關(guān)顱:查無(wú)活動(dòng)性出血后，涂抹青霉素軟膏，縫合小鼠頭部皮膚。將小鼠放置溫度為37℃的熱板中，使小鼠緩慢恢復(fù)。

GAP-43和p-GAP-43表達(dá)情況的檢測(cè)將正常對(duì)照小鼠與不同時(shí)期模型鼠的海馬組織經(jīng)4%甲醛浸泡48 h，逐級(jí)進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋，切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。注射KA后5d處死小鼠，取其注射側(cè)海馬提取蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

免疫組織化學(xué)檢測(cè):4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定后制作成組織蠟塊，隨后切片、貼片;脫蠟至水;進(jìn)行Tris-檸檬酸高溫高壓熱抗原修復(fù)3 min，立刻停止后將切片在緩沖液中逐步降至室溫;加入配好的0.3%過(guò)氧化氫溶液30 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的影響，0.01 mol/L PBS清洗 (5 min×3次);加入配好的0.3%Triton X100室溫30 min，以增加細(xì)胞的通透性，0.01 mol/L PBS(5 min×3次);加入3%BSA室溫封閉1 h;加入用1%BSA稀釋的一抗，4℃孵育過(guò)夜或室溫孵育1 h，0.01 mol/L PBS清洗 (5 min×3次);加入用1%BSA稀釋的的二抗，室溫孵育1 h。0.01 mol/L PBS洗 (5 min×3次);加入顯色液DAB，進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，待細(xì)胞達(dá)到最大反應(yīng)時(shí)吸去顯色液，用蒸餾水迅速?zèng)_3次;梯度酒精脫水之后，封片，拍照。

SDS-PAGE電泳及Western blot分析:將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，常規(guī)配置轉(zhuǎn)移緩沖液 (pH 8.3)，冰浴下100V轉(zhuǎn)膜1 h;將轉(zhuǎn)膜后的硝酸纖維素膜置于TBST緩沖液中沖洗1次，將膜轉(zhuǎn)入5%脫脂奶粉的封閉液中封閉硝酸纖維素膜上的免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)，室溫封閉30 min;加入用封閉液稀釋至工作濃度的第一抗體溶液，室溫賦予1 h或4℃過(guò)夜，之后置于TBST緩沖液中洗3次，5～10 min/次;加入用封閉液稀釋的第二抗體溶液，室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗3次，5 min/次;通過(guò)ECL-X光片曝光方法顯影。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理Western Blot與免疫組織化學(xué)結(jié)果采用ImageJ 1.42q軟件進(jìn)行灰度值分析，并采用Prism 5(5.01版本)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將對(duì)照組平均灰度值定位1，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組平均灰度值相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)或百分比，組間差異分析采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

GAP-43在癲癇發(fā)生不同時(shí)期的空間分布GAP-43在正常對(duì)照小鼠及MTLE模型鼠海馬齒狀回、門(mén)區(qū)和齒狀回內(nèi)分子層 (inner molecular layer，IML)區(qū)域均有表達(dá)，MTLE潛伏期 (5d)與慢性期 (2周)海馬注射側(cè)表達(dá)量變化的空間分布無(wú)顯著差異 (圖1)。

p-GAP-43在癲癇發(fā)生不同時(shí)期的表達(dá)p-GAP-43在正常海馬中的空間分布與GAP-43相似，主要定位于顆粒細(xì)胞的胞質(zhì)及細(xì)胞膜上。與正常對(duì)照組相比，p-GAP-43蛋白表達(dá)水平在KA注射后第5天有所下降，在注射后第14天進(jìn)一步降低，且齒狀回顆粒細(xì)胞散布明顯 (圖1)。p-GAP-43在KA注射后第5天與對(duì)照組相比下調(diào)約30%，在KA注射后第14天表達(dá)下調(diào)70%左右 (圖2)。對(duì)注射側(cè)海馬內(nèi)p-GAP-43表達(dá)的進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常小鼠相比，注射后第5天海馬內(nèi)p-GAP-43蛋白水平下調(diào)約50%(圖3)。

KA注射后第35天，模型小鼠的顆粒細(xì)胞散布進(jìn)一步擴(kuò)大，癲癇發(fā)作頻率也隨之升高。在MTLE模型鼠慢性期第5周取海馬組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示p-GAP-43在正常對(duì)照小鼠海馬齒狀回表達(dá)較高，在注射KA對(duì)側(cè)的海馬齒狀回表達(dá)則明顯下調(diào);與對(duì)照組和注射對(duì)側(cè)DG區(qū)相比，注射KA側(cè)p-GAP-43表達(dá)顯著下降。在正常小鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的胞膜與胞質(zhì)中，p-GAP-43均有表達(dá)，尤以胞膜中染色較強(qiáng)，注射后第5天時(shí)染色明顯變淺，至注射后第2周時(shí)在胞膜中已幾乎不見(jiàn)表達(dá) (圖4)。

圖1 GAP-43與p-GAP-43在MTLE模型鼠5d、2周時(shí)間點(diǎn)海馬齒狀回中的表達(dá)分布Fig 1 Immunostaining of GAP-43 and p-GAP-43 in the dentate gyrus of MTLE mouse model 5 days and 2 weeks after KA injection

圖2 p-GAP-43在MTLE模型鼠5 d與2w時(shí)間點(diǎn)注射側(cè)海馬齒狀回中的免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度分析 (n=3)Fig 2 Immunoreactivity of p-GAP-43 in the dentate gyrus of KA injected hippocampus 5 days and 2 weeks after KA injection(n=3)

圖3 KA注射5d后 (潛伏期)，注射側(cè)海馬內(nèi)p-GAP-43表達(dá)量下調(diào) (n=3)Fig 3 Decreased expression levels of p-GAP-43 5 days after KA injection(n=3)

討 論

圖4 p-GAP-43在MTLE模型鼠5周時(shí)間點(diǎn)海馬齒狀回中的表達(dá)變化Fig 4 Immunostaining of p-GAP-43 in the dentate gyrus of MTLE mouse model 5 weeks after KA injection

GAP-43作為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和軸突再生的關(guān)鍵因子，廣泛參與神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)、分化，突觸的維持，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和神經(jīng)組織的異常芽生。GAP-43被認(rèn)為在引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)軸突形成新的聯(lián)系上發(fā)揮關(guān)鍵作用，并參與軸突損傷后的再生過(guò)程［5］。該蛋白在神經(jīng)軸突生長(zhǎng)和突觸形成時(shí)期十分活躍［9］，不過(guò)在大多數(shù)神經(jīng)元中，當(dāng)生長(zhǎng)軸突接觸到合適的目標(biāo)后，轉(zhuǎn)運(yùn)到生長(zhǎng)錐中的GAP-43數(shù)量減少，繼而生長(zhǎng)錐會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橥挥|前成分［10］。本研究結(jié)果顯示，GAP-43在正常對(duì)照小鼠及MTLE模型鼠海馬齒狀回、門(mén)區(qū)和齒狀回IML區(qū)域均有表達(dá)，p-GAP-43在此區(qū)域的染色模式與GAP-43相近不過(guò)表達(dá)量下調(diào)，而MTLE中異常神經(jīng)環(huán)路的建立可能依賴(lài)于突觸網(wǎng)絡(luò)的重塑，由此推測(cè)GAP-43在齒狀回區(qū)域的高表達(dá)可能通過(guò)參與突觸重塑過(guò)程進(jìn)而影響到MTLE異常放電環(huán)路的建立。以往研究報(bào)道，GAP-43在成年大鼠海馬中的表達(dá)升高可能是由于該組織中突觸結(jié)構(gòu)可塑性處于高位［11］。Tolner等［12］采用電刺激和KA注射誘導(dǎo)大鼠的癲癇持續(xù)狀態(tài)，24h后檢測(cè)GAP-43在海馬區(qū)的表達(dá)分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IML區(qū)域GAP-43的表達(dá)下調(diào)可能與門(mén)區(qū)神經(jīng)元的丟失相關(guān)。在癲癇動(dòng)物模型中的研究發(fā)現(xiàn)，投射到海馬IML區(qū)的門(mén)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞丟失與苔蘚樣纖維出芽可能存在著密切的關(guān)系［13-14］。在本研究建立的模型中亦成功驗(yàn)證了MTLE苔蘚樣纖維出芽和CA區(qū)神經(jīng)元丟失這兩大標(biāo)志性病理改變。

本研究采用KA誘導(dǎo)的顳葉癲癇模型小鼠，在癲癇發(fā)生潛伏期和慢性期的代表性時(shí)間點(diǎn)，即KA注射后的第5天 (潛伏期)、第14天及第5周 (慢性期)，檢測(cè)了海馬內(nèi)p-GAP-43的表達(dá)水平和分布，結(jié)果顯示，p-GAP-43在硬化海馬中的齒狀回顆粒細(xì)胞中逐步下調(diào)，推測(cè)可能與硬化海馬內(nèi)的神經(jīng)環(huán)路重建相關(guān)。GAP-43作為PKC和Ⅱ型酪蛋白激酶(casein kinaseⅡ，CKⅡ)的磷酸化作用底物，其中CKⅡ可對(duì)GAP-43的191/192位絲氨酸位點(diǎn)和88/89位蘇氨酸位點(diǎn)等多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化，而PKC則被實(shí)驗(yàn)證明僅磷酸化GAP-43的41位絲氨酸［15］。非磷酸化的GAP-43可通過(guò)1個(gè)“IQ”模體與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，而在其41位絲氨酸被磷酸化后與鈣調(diào)蛋白的結(jié)合則被抑制。Caprini等［16］采用表達(dá)克隆的方法研究了人后根神經(jīng)節(jié)胞內(nèi)鈣離子的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GAP-43能增加胞內(nèi)鈣離子濃度，抑制PKC的活動(dòng)能消除由GAP-43誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的提高，而細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高通常被認(rèn)為是癲癇鼠模型中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)因素，可能對(duì)誘導(dǎo)癲癇的發(fā)作起到促進(jìn)作用。另一方面，在生長(zhǎng)錐中磷酸化的GAP-43高表達(dá)區(qū)域有較強(qiáng)黏附靶標(biāo)細(xì)胞的活性，而非磷酸的GAP-43 則定位于相應(yīng)功能較弱區(qū)域［17］。He等［18］研究發(fā)現(xiàn)，此種差異可能是由GAP-43對(duì)肌動(dòng)蛋白絲的調(diào)節(jié)而實(shí)現(xiàn)的，并且這種調(diào)節(jié)功能與其本身41位絲氨酸被磷酸化水平相關(guān)。因此，p-GAP-43在MTLE潛伏期與慢性期的齒狀回顆粒細(xì)胞中的顯著下調(diào)可能影響突觸的形成，進(jìn)而參與到硬化海馬中異常神經(jīng)環(huán)路的建立過(guò)程。

綜上，本研究結(jié)果顯示，在MTLE模型小鼠的潛伏期與慢性期，磷酸化的GAP-43隨著癲癇發(fā)生時(shí)間的推移而下調(diào)可能通過(guò)影響軸突骨架的穩(wěn)定和軸突的靶向生長(zhǎng)而參與到硬化海馬的突觸重組過(guò)程，為癲癇發(fā)生過(guò)程中異常神經(jīng)環(huán)路的建立提供有利條件。

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