黃 樺，張 峻，馬潤(rùn)玫，閆 晨，鄭巧玲，姚 勤

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.臨床藥學(xué)科，2.婦產(chǎn)科，云南昆明 650032)

研究表明，有23% ～85%的妊娠期婦女在妊娠期間須接受藥物治療［1］，使得妊娠期用藥安全性受到社會(huì)日益關(guān)注。然而，由于妊娠期用藥研究涉及倫理原則，人們很少或不能做人類的前瞻性研究，目前主要的參考依據(jù)仍源于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或回顧性臨床研究。但是，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所提供的藥物致畸作用信息鑒于種屬差異不能保證用于人類毫無(wú)風(fēng)險(xiǎn);而回顧性臨床研究周期長(zhǎng)，工作量大，收集病例困難，存在一定的倫理風(fēng)險(xiǎn)，且得到的數(shù)據(jù)只能為胎兒的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供概率。面對(duì)不可避免的妊娠期用藥，有限的安全性信息不足以為胎兒的安全性提供保障。因此，進(jìn)一步完善妊娠期用藥的安全性信息，為臨床提供直接、有力、可信的妊娠期用藥安全性依據(jù)具有重要意義。

胎兒風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中一個(gè)重要的關(guān)鍵性因素是胎兒的藥物暴露量，即藥物經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)的程度，因此，進(jìn)行藥物的胎盤透過性研究是評(píng)價(jià)妊娠期用藥安全性的重要依據(jù)。

人類胎盤體外循環(huán)灌注模型是將剛分娩出的胎盤進(jìn)行小葉分離、灌注，建立母體面和胎兒面的雙向循環(huán)，在體外模擬人體子宮，為原來(lái)無(wú)法在妊娠期婦女體內(nèi)完成的胎盤透過性研究提供了一種可行的途徑［2－3］。該模型目前已成為研究外來(lái)物質(zhì)(如藥物、毒物、環(huán)境污染物等)能否透過胎盤、對(duì)胎兒造成暴露的經(jīng)典模型［3－5］。

迄今，國(guó)內(nèi)尚無(wú)應(yīng)用該模型進(jìn)行藥物透過性研究的報(bào)道，國(guó)外已應(yīng)用該模型進(jìn)行了格列本脲［6］、卡鉑［7］、美羅培南［8］、二甲雙胍［9］和雙酚 A［10］等多種藥物的胎盤透過性研究。鑒于種族差異不可將國(guó)外研究結(jié)果貿(mào)然用于中國(guó)人種，因此，為了完善中國(guó)妊娠期婦女用藥安全性信息，本研究以安替比林為參照物，結(jié)合離體胎盤小葉灌注技術(shù)，在國(guó)內(nèi)首次研制并建立人類胎盤體外循環(huán)灌注模型［11］，為妊娠期用藥安全性評(píng)價(jià)提供新的實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 胎盤

自然分娩或剖宮產(chǎn)剛娩出的健康、完整和足月的人類胎盤20個(gè)，由昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，均為患者簽字同意交醫(yī)院處理。待胎盤娩出后，浸于預(yù)先冷藏保存的含肝素生理鹽水中，10 min內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，20 min內(nèi)建立循環(huán)。

1.2 試劑與儀器

安替比林對(duì)照品，購(gòu)自Adamas-beta公司，批號(hào):P05396，純度:98%;Krebs-Ringer干粉，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào):070M8303;牛血清白蛋白，批號(hào):10735078001，購(gòu)自美國(guó) Biosharp公司;碳酸氫鈉注射液，批號(hào):12030423，購(gòu)自濟(jì)南利民制藥有限責(zé)任公司;0.9%氯化鈉注射液，批號(hào):M12100412，購(gòu)自四川科倫藥業(yè)股份有限公司;肝素鈉注射液，批號(hào):1201111，購(gòu)自江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司;水為自制超純水。

Simplicity純水儀，美國(guó)Millipore公司;蠕動(dòng)泵，配有Masterflex L/S 07523-90泵控制臺(tái)，Masterflex L/S easy-loadⅡ泵頭，美國(guó) Cole-Parmer公司;磁力攪拌器，常州國(guó)華電器有限公司;恒溫水浴鍋HH-6，常州國(guó)華電器有限公司;恒溫加熱箱(自制);密閉式靜脈留置針20G×1.16〞，批號(hào):1322498，美國(guó)BD公司;SH138-ISTAT血?dú)夥治鰞x，美國(guó)雅培公司;動(dòng)脈采血器，批號(hào):1284336，美國(guó)BD公司;i-STAT G3+血?dú)夥治銎偛?，批?hào):N13054，美國(guó)雅培公司。

1.3 胎盤體外循環(huán)的建立

胎盤結(jié)構(gòu)如圖1所示。選擇供應(yīng)同一胎盤小葉的一對(duì)臍動(dòng)靜脈，穿刺插管后建立單個(gè)胎盤小葉的胎兒循環(huán);胎兒面向下固定于胎盤室內(nèi)，置于37℃恒溫水浴中，將一端接有導(dǎo)管的兩根鈍頭針插入同一胎盤小葉的絨毛間隙內(nèi)2～3 mm，模擬子宮螺旋動(dòng)脈，建立母體循環(huán)(圖2)。以蠕動(dòng)泵為循環(huán)動(dòng)力，分別向母體和胎兒循環(huán)泵入灌流液，建立同一個(gè)胎盤小葉母體側(cè)和胎兒側(cè)的雙向閉合循環(huán)。

Fig.1 Structure of the human placenta.

Fig.2 Schematic diagram of placenta cannula.A:fetal surface(a fetal vein－artery pair supplying a well defined cotyledon was identified.The fetal vessels were cannulated，and the flow of perfusate is established).B:maternal surface(the lobule was clamped with the fetal side downward into a chamber.Perfusion of the maternal side began with insertion of blunt-tipped needles into the intervillous space 2－3 mm below the decidual surface).

人類胎盤體外循環(huán)灌注模型如圖3所示，整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)置于37℃恒溫箱內(nèi)。胎盤灌流液為Krebs-Ringer緩沖液［6，12］，含白蛋白 22.5 g·L－1，加入適量碳酸氫鈉注射液調(diào)節(jié)其pH值于7.2～7.4;使用前加熱至37℃，并通過磁力加熱攪拌器保持恒溫(磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為4.5×g)。

Fig.3 Schematic presentation of human placental perfusion experimental setup.1:perfusion chamber;2:maternal reservoir;3:fetal reservoir;4:maternal artery;5:maternal vein;6:fetal artery;7:fetal vein;8:peristaltic pump;9:magnetic stirring apparatus;10:37℃ incubator.

1.4 胎盤體外循環(huán)灌注模型評(píng)價(jià)指標(biāo)的檢測(cè)

1.4.1 胎兒循環(huán)側(cè)漏液率的檢測(cè)

母體側(cè)和胎兒側(cè)循環(huán)建立后，在循環(huán)持續(xù)時(shí)間內(nèi)，觀察胎兒循環(huán)側(cè)液體儲(chǔ)備池中液體的體積有無(wú)變化。由于水分的自然蒸發(fā)以及胎兒側(cè)循環(huán)需要施加一定壓力等原因，允許胎兒側(cè)液體有少量的損失。循環(huán)結(jié)束時(shí)量取胎兒循環(huán)側(cè)液體儲(chǔ)備池中液體的體積，計(jì)算液體滲漏量及滲漏率。若胎兒循環(huán)側(cè)的滲漏率≤4 m·lh－1［3］，則符合循環(huán)建立成功的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.4.2 安替比林透過率的檢測(cè)

安替比林可通過被動(dòng)擴(kuò)散的方式透過胎盤屏障進(jìn)入胎兒循環(huán)，且安替比林的胎盤透過率不受灌流液中蛋白含量以及灌流液中其他藥物的影響，是胎盤透過性研究的常用陽(yáng)性標(biāo)記物［3，8，14－18］。循環(huán)開始前30 min，母體池中通入混合氧氣(95%氧氣+5%二氧化碳，25～35 kPa)，以提高母體池中灌流液的含氧量，模擬母體動(dòng)脈血的真實(shí)情況;胎兒池中通入混合氮?dú)?95%氮?dú)?5%二氧化碳，15～20 kPa)，以降低胎兒池中灌流液的含氧量，模擬胎兒臍動(dòng)脈血的真實(shí)情況。30 min預(yù)灌注后，母體池和胎兒池通氣壓力分別調(diào)整為20～30和10～15 kPa，同時(shí)在母體池中加入25 mg安替比林，使其中安替比林濃度為100 mg·L－1。循環(huán)灌注 3 h，母體側(cè)流速12 ml·min－1，胎兒側(cè)流速3 m·lmin－1。于循環(huán)開始后 0，5，10，15，20，30，45，60，75，90，105，120，150和180 min分別抽取胎兒池中樣品，按本實(shí)驗(yàn)室所建HPLC法［13］測(cè)定胎盤灌流液中安替比林的濃度。當(dāng)安替比林經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)達(dá)到平衡后，其胎盤透過率＞20%［18－20］便可認(rèn)為該模型建立成功。胎盤透過率公式為:透過率=CF/CM×100%，其中CF表示在胎兒循環(huán)側(cè)的藥物濃度，CM表示母體循環(huán)側(cè)的最初藥物濃度。

1.4.3 胎盤灌流液pH值的測(cè)定

人類胎盤體外循環(huán)灌注模型在體外模擬母體循環(huán)和胎兒循環(huán)，為保證整個(gè)循環(huán)過程中胎盤的活性，模擬母體和胎兒血液的母體池和胎兒池中灌流液pH值在整個(gè)循環(huán)過程中需控制在 7.2 ～7.4［14，19，20］，否則認(rèn)為建模失敗。實(shí)驗(yàn)中于循環(huán)開始后0，30，60，90，120，150和180 min分別抽取母體池和胎兒池中樣品進(jìn)行血?dú)夥治觯瑴y(cè)定pH值。

2 結(jié)果

2.1 人胎盤體外循環(huán)灌注模型中的胎兒循環(huán)側(cè)漏液率

本研究建立的20例人類胎盤體外循環(huán)灌注模型的胎兒側(cè)漏液率如表1所示，胎兒側(cè)漏液率在0.17 ～3.90 ml·h－1之間，均 ＜ 4 ml·h－1，平均2.47 ±1.27 ml·h－1符合循環(huán)建立成功的評(píng)價(jià)指標(biāo)，提示模型成功建立。

Tab.1 The loss from fetal reservoir and placental antipyrine transfer rate in human placental perfusion model

2.2 人胎盤體外循環(huán)灌注模型中安替比林的透過率

安替比林經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)達(dá)到平衡后的透過率如表1所示，安替比林經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)的透過率-時(shí)間圖如圖4所示，當(dāng)灌流循環(huán)至100 min左右時(shí)，安替比林的胎盤透過率＞20%;當(dāng)灌流循環(huán)至150～180 min時(shí)，安替比林的胎盤透過率趨于平衡，循環(huán)結(jié)束時(shí)其平均胎盤透過率為(36.62±5.08)%。

Fig.4 Placental antipyrine transfer rate in 3 h in human placental perfusion model.During the perfusion，samples were collected at 0，5，10，15，20，30，45，60，75，90，105，120，150 and 180 min from the fetal reservoir after addition of antipyrine.The samples were detected by HPLC.±s，n=20.

2.3 人胎盤體外循環(huán)灌注模型中胎盤灌流液的pH值

由表2可知，3 h持續(xù)循環(huán)過程中，母體池和胎兒池灌流液pH值均維持在7.2～7.4范圍內(nèi)。

Tab.2 pH of placental perfusate in human placental perfusion model

本研究所建立的人類胎盤體外循環(huán)灌注模型胎兒側(cè)漏液率、安替比林透過率和循環(huán)過程中灌流液pH值均達(dá)到模型評(píng)價(jià)指標(biāo)的要求，20例人類胎盤體外循環(huán)灌注模型建立成功。

3 討論

人類胎盤體外循環(huán)灌注模型遵守醫(yī)學(xué)倫理道德規(guī)范，不僅沒有種屬差異的限制，還在體外保留了完整的人類胎盤組織，完全按照人體子宮內(nèi)胎盤循環(huán)原理設(shè)計(jì)，能夠真實(shí)模擬孕婦、胎盤及胎兒三者血液循環(huán)在子宮內(nèi)的狀況，可直接反映人體胎盤的吸收、代謝和分泌功能以及藥物的透過性。

本研究選取的是自然分娩或剖宮產(chǎn)剛娩出的、足月、完整的健康人類胎盤，且胎盤組織不能有任何破裂、損傷，要有完整的羊膜。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，如果胎盤組織有破裂或羊膜不完整會(huì)導(dǎo)致胎兒側(cè)循環(huán)漏液。因此胎盤的選取是影響胎盤體外循環(huán)灌注模型是否能夠成功建立的重要因素。

保證胎盤的活性是保證試驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素。為了更長(zhǎng)時(shí)間保持胎盤的活性，試驗(yàn)中需要嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件。首先，胎盤體外循環(huán)的建立應(yīng)在胎盤娩出后30 min內(nèi)完成，這就要求研究人員需要掌握熟練的離體胎盤小葉穿刺和灌注技術(shù)。

其次，試驗(yàn)過程中還應(yīng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)胎兒池和母體池中的溫度、pH值，使胎兒側(cè)和母體側(cè)液體儲(chǔ)備池中灌流液的溫度控制在36.5～37.5℃，pH值控制在7.2 ～7.4。

除上述條件外，還需模擬正常人體內(nèi)和胎兒體內(nèi)動(dòng)靜脈血液中的氣體分壓。正常人體動(dòng)脈血液富含氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其血氧飽和度為98%。灌流液中氧飽和度的變化可影響循環(huán)過程中胎盤的活性，從而影響藥物的胎盤透過率。Bachmaier等［21］利用人類胎盤體外循環(huán)灌注模型考察了不同供氧程度對(duì)安替比林胎盤透過率的影響，利用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察灌流前后胎盤組織的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果表明，降低灌流液的供氧量可引起胎盤絨毛結(jié)構(gòu)的改變，安替比林的胎盤透過率也會(huì)因此大大降低。為了觀察通入氧氣前后灌流液中氧飽和度的變化，抽取灌流液進(jìn)行氧飽和度和氧分壓測(cè)定，未通入氧氣時(shí)的氧分壓為71 mmHg、氧飽和度為91%，以25～35 kPa的壓力通入氧氣30 min后氧分壓為323 mmHg、氧飽和度為100%。結(jié)果表明，循環(huán)開始前30 min向灌流液中通入氧氣可有效提高其氧分壓和氧飽和度，為迅速改善離體胎盤組織的缺氧狀況、維持胎盤的正常功能提供了保障。

綜上所述，本研究在國(guó)內(nèi)首次成功建立了人類胎盤體外循環(huán)灌注模型，該模型可進(jìn)行藥物和毒物等外源性物質(zhì)的胎盤透過性研究，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)利用體外模型進(jìn)行人類胎盤透過性研究的空白，為原來(lái)無(wú)法在妊娠期婦女體內(nèi)完成的藥物安全性研究提供了一種可行的途徑，為妊娠期用藥安全性提供了可靠的體外研究模型和理論支持。

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